本文關(guān)鍵詞：c-Ski基因?qū)π×和ǖ婪克饬髯枇Φ恼{(diào)控及機制研究

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【摘要】：背景和目的：原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)是眼睛疾病當中遲發(fā)性、進行性且不可逆的主要致盲眼病之一,目前其發(fā)病機制尚未完全清楚,但一般認為眼壓升高是其中主要的危險因素。因此,降眼壓一直是眼科治療青光眼的主要手段�，F(xiàn)今大多數(shù)降眼壓藥物療效不理想,且有一定的副作用。一旦患上青光眼就需要長期用藥,因此也存在高額費用及治療的依從性不佳等問題。此外,就藥物作用機理而言,除膽堿能激動劑(如匹羅卡品)外,其他降眼壓藥并未針對房水的主要排出通道即小梁通道起作用。因而,在目前降眼壓治療存在許多問題的情況下,基因治療的引入有特殊的意義。本課題將TGF-β/Smad信號通路輔阻遏因子c-Ski基因?qū)氪笫笄胺?探討c-Ski基因表達對大鼠眼壓的影響、可能的機制和轉(zhuǎn)基因表達的副作用。以上研究國內(nèi)外尚無報道。該項課題可望闡明用c-Ski基因治療青光眼的可行性,為廣大青光眼患者的治療帶來新的希望!研究目的包括：1、構(gòu)建c-Ski基因的慢病毒表達載體,在293TN細胞中合成和收獲病毒；2、慢病毒轉(zhuǎn)導小梁細胞,探討c-Ski在細胞水平的表達及其可能的影響眼壓機制；3、將病毒一次性導入大鼠前房,觀察c-Ski的表達對眼壓的影響及眼內(nèi)毒性反應(yīng)等,初步探討c-Ski影響眼壓的機制。方法：1.構(gòu)建同時表達c-Ski和GFP基因的慢病毒載體(HIV-c-Ski/GFP),并證實在細胞水平上表達目的蛋白；僅表達GFP基因的慢病毒載體(HIV-GFP)作為對照,下同。包裝成具有感染(轉(zhuǎn)導)能力的病毒顆粒。2. HIV-c-Ski/GFP轉(zhuǎn)導培養(yǎng)的人眼小梁細胞(trabecular meshwork cells,TMCs);觀察轉(zhuǎn)基因表達的時間及其對細胞形態(tài)、細胞外基質(zhì)、肌動蛋白細胞骨架及其細胞連接的影響。3.采用SD大鼠做實驗。HIV-c-Ski/GFP轉(zhuǎn)導大鼠眼,與對照相比,檢測轉(zhuǎn)基因表達對眼壓的影響,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在小梁通道表達及其對小梁大體形態(tài)的影響,并觀察可能存在的副作用如炎癥反應(yīng)等。結(jié)果：1、成功構(gòu)建pCDF 1-MCS2-EF1-copGFP-C-Ski表達載體,經(jīng)酶切和測序鑒定,僅有一處堿基改變,即第1476位的C突變?yōu)門,但不影響所編碼的氨基酸,其他序列完全相同。經(jīng)293TN細胞包裝后收獲了病毒HIV-c-Ski和HIV-GFP,病毒滴度均為3.4×108 TU/ml。2、Western-blot結(jié)果顯示：Ski在HIV-c-Ski、HIV-GFP感染小梁細胞及未處理小梁細胞中均有表達。HIV-c-Ski感染的小梁細胞Ski表達增強,證實轉(zhuǎn)導成功。免疫熒光結(jié)果顯示,和HIV-GFP組和空白細胞組相比,HIV-c-Ski人小梁細胞肌動蛋白骨架降解,β-catenin蛋白表達減弱。3、治療組和對照組的基線眼壓(10：00-11：00)分別為13.02±0.48mmHg和13.05±0.52mmHg,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05,n=12)。病毒注射后第11天,治療組眼壓開始下降,與對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)；第13天開始,治療組眼壓與基線眼壓及對照組眼壓相比,差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；之后治療組眼壓持續(xù)下降,穩(wěn)定在一個相對低水平,直至第21天處死。納入的12只大鼠未見明顯的角膜、前房炎癥反應(yīng)及其它眼部異常。4、免疫細胞化學結(jié)果顯示：大鼠前房注射病毒后4周,實驗組小梁網(wǎng)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和細胞肌動蛋白骨架蛋白均表達減弱。結(jié)論：1、成功構(gòu)建pCDF 1-MCS2-EF1-copGFP-c-Ski慢病毒表達載體,在293TN細胞中包裝得到具有感染能力的病毒顆粒。2、病毒轉(zhuǎn)導小梁細胞,在小梁細胞中表達c-Ski,并經(jīng)免疫細胞化學和Western-blot證實,c-Ski基因可引起人小梁細胞肌動蛋白骨架的降解及細胞連接蛋白β-catenin表達減少。3、慢病毒介導的c-Ski在大鼠小梁網(wǎng)ECM蛋白的表達及肌動蛋白和相關(guān)連接蛋白的表達減弱。4、HIV-c-Ski前房內(nèi)注射能降低大鼠眼壓,治療效果優(yōu)于HIV-GFP組。其降眼壓機制可能是通過小梁通道表達c-Ski基因抑制TGF-β/Smad信號通路,降解肌動蛋白和ECM來實現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：C-Ski 基因治療 青光眼 眼壓 慢病毒
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R775.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-11
• 前言11-16
• 參考文獻14-16
• 第一部分 c-Ski慢病毒表達載體構(gòu)建及慢病毒的包裝純化16-41
• 材料與方法16-30
• 結(jié)果30-36
• 討論36-38
• 小結(jié)38-39
• 參考文獻39-41
• 第二部分 慢病毒介導的c-Ski在小梁細胞中的表達41-59
• 材料與方法41-48
• 結(jié)果48-51
• 討論51-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻56-59
• 第三部分 慢病毒介導的c-Ski大鼠眼內(nèi)表達對眼壓的影響59-77
• 材料與方法59-66
• 結(jié)果66-70
• 討論70-72
• 小結(jié)72-74
• 參考文獻74-77
• 全文結(jié)論77-78
• 英漢縮略詞對照表78-79
• 致謝79-80
• 文獻綜述80-107
• TGF-β/Smads信號傳導通路在后發(fā)性白內(nèi)障中的研究進展80-91
• 參考文獻87-91
• The triblock copolymers hydrogel through intracameral injection may be a new potential ophthalmic drug delivery with antiscaring drugs after glaucoma filtration surgery91-107
• References100-107

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本文編號：829978