本文關(guān)鍵詞：DFNA5生物學(xué)功能和致聾機(jī)制初探

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【摘要】：在所有己被克隆的耳聾基因中,DFNA5(Deafness, Autosomal Dominant Nonsyndromic Sensorineural5)是為數(shù)不多的目前為止其生物學(xué)功能及致聾機(jī)制仍不清楚的基因之一。1995年DFNA5被定位于7號(hào)染色體15區(qū)7p15,是第五個(gè)被定位的常染色體顯性遺傳性耳聾位點(diǎn)。1998年DFNA5基因被克隆,突變位點(diǎn)也被找到。到目前為止,已有多個(gè)DFNA5基因的突變被發(fā)現(xiàn)能夠引起耳聾,盡管這些位點(diǎn)在基因組水平都不一樣,但所有引起耳聾的DFNA5基因突變都在mRNA水平使第8外顯子漏讀從而造成開(kāi)放閱讀框移框,在繼續(xù)翻譯41個(gè)本來(lái)并不存在的氨基酸后提前終止 現(xiàn)在一般認(rèn)為引起耳聾的DFNA5基因突變是一個(gè)功能獲得性(gain of function)突變,可能與第8外顯子漏讀引起的錯(cuò)誤翻譯的41個(gè)氨基酸有關(guān),理由如下：1)引起耳聾的DFNA5突變都是顯性突變；2)耳聾相關(guān)的突變型DFNA5轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠引起細(xì)胞死亡的增加,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞則引起細(xì)胞周期停滯；3)DFNA5基因第5外顯子的一個(gè)突變也造成開(kāi)放閱讀框提前終止,但并不引起耳聾。為了在小鼠中模擬人DFNA5耳聾突變,Van Laer L及同事利用同源重組敲除小鼠DFNA5第8外顯子,造成開(kāi)放閱讀框移框從而在繼續(xù)翻譯43個(gè)原本不存在的氨基酸后提前終止翻譯(小鼠DFNA5突變錯(cuò)誤翻譯的43個(gè)氨基酸與人DFNA5耳聾突變錯(cuò)誤翻譯的41個(gè)氨基酸沒(méi)有同源性)。ABR檢測(cè)結(jié)果顯示該小鼠并沒(méi)有耳聾表型。這也提示我們?nèi)薉FNA5基因第8外顯子漏讀引起的錯(cuò)誤翻譯的41個(gè)氨基酸可能對(duì)耳聾的發(fā)生很重要。 本論文在細(xì)胞水平對(duì)DFNA5蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行研究,并對(duì)DFNA5突變的致聾機(jī)制進(jìn)行初步探討。本文第一部分主要對(duì)DFNA5生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。我們利用分子克隆方法構(gòu)建了細(xì)胞轉(zhuǎn)染、酵母雙雜交、GST-pull down等表達(dá)載體。DFNA5在COS7細(xì)胞的亞細(xì)胞定位表明,野生型DFNA5定位在細(xì)胞質(zhì)中,但是將引起耳聾的DFNA5突變型轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中后,貼壁細(xì)胞變少,且蛋白在細(xì)胞質(zhì)中定位不均勻,聚集成團(tuán)。我們用酵母雙雜交、GST-pul、IP方法試圖鑒定DFNA5相互作用蛋白。遺憾的是,由于細(xì)胞毒性及蛋白容易失活等原因,目前為止沒(méi)有得到作用蛋白。 Hermann Lage等將DFNA5穩(wěn)轉(zhuǎn)入MeWo ETO1細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染有DFNA5的細(xì)胞系與對(duì)照組相比依托泊苷敏感性降低30-35%。他們利用合成熒光探針DEVD-AFC多肽檢測(cè)caspase3活性,發(fā)現(xiàn)DFNA5急轉(zhuǎn)細(xì)胞系會(huì)使caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。在本文第二部分中,我們通過(guò)western blot等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步檢測(cè)了DFNA5寸細(xì)胞死亡的調(diào)控。同時(shí),我們利用高通量測(cè)序的方法,篩選DFNA5下游調(diào)控基因,以進(jìn)一步了解DFNA5突變影響細(xì)胞凋亡的機(jī)制。我們的工作為深入認(rèn)識(shí)DFNA5的生物學(xué)功能及突變致聾機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：DFNA5 細(xì)胞凋亡 耳聾
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：Q75;R764.43
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• ~.略詞表10-12
• 前言12-20
• 第一部分 DFNA5生物學(xué)功能的研究20-58
• 第一章 DFNA5基因的克隆,表達(dá)載體的構(gòu)建22-30
• 第二章 DFNA5的亞細(xì)胞定位30-40
• 第三章 DFNA5作用蛋白的鑒定40-58
• 第一節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與DFNA5相互作用的蛋白40-48
• 第二節(jié) GST-pull down方法鑒定DFNA5作用蛋白48-53
• 第三節(jié) 免疫沉淀(IP)方法鑒定DFNA5作用蛋白53-58
• 第二部分 DFNA5突變的致聾機(jī)制58-76
• 第四章 DFNA5對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)控60-66
• 第五章 DFNA5下游基因的鑒定66-76
• 第三部分 結(jié)論與討論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-82
• 致謝82-83
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表83

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：774004