本文關(guān)鍵詞：AQP1在視網(wǎng)膜激光損傷中的表達及其變化研究

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【摘要】：研究背景 高新技術(shù)發(fā)展迅猛，軍事領(lǐng)域中各種新概念武器不斷被研發(fā)，激光致盲武器就是其中之一。同時，高新技術(shù)給醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也帶來了嶄新的革命，在眼科領(lǐng)域中出現(xiàn)了諸如：激光矯正治療屈光不正，激光手術(shù)治療白內(nèi)障，激光治療眼底視網(wǎng)膜病變等等，這些高新技術(shù)的出現(xiàn)極大的推動了眼科學(xué)的發(fā)展，也給無數(shù)的病患帶來了福音。但是，伴隨著這些有利因素，高新技術(shù)的不適使用、過度應(yīng)用等由此帶來的一些不利因素也逐漸顯現(xiàn)出來。眼睛對外來的光線極為敏感，它最容易受到強光照射而引起損傷。將一束400－900納米波長范圍的激光向角膜照射，經(jīng)過屈光介質(zhì)的匯聚后，單位區(qū)域視網(wǎng)膜上所吸收的激光照射能量比照射角膜的量提高近105倍。所以，因此，激光照射可引起視網(wǎng)膜損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致視力下降和失明。一旦視網(wǎng)膜受損，如何減少視網(wǎng)膜的受損程度，恢復(fù)視功能成了人們關(guān)注的主要問題。 強光照射后最初引起視網(wǎng)膜色素上皮層的改變，色素上皮層中的色素顆粒將吸收的光能轉(zhuǎn)換為熱能，這就破壞了視網(wǎng)膜色素上皮細胞之間的緊密連接，使它脫離Bruchs膜，導(dǎo)致血視網(wǎng)膜外屏障的損傷。研究表明，激光對視網(wǎng)膜的損傷與血－視網(wǎng)膜屏障損傷有直接的關(guān)系。血－視網(wǎng)膜外屏障損傷能夠使脈絡(luò)膜的組分滲漏到視網(wǎng)膜，引起視網(wǎng)膜水腫，導(dǎo)致視力急劇下降，甚至失明。 水通道蛋白（AQPs）是最近發(fā)現(xiàn)的一種對水分子具備極高選擇性的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要分13種亞型(AQP0-12)，在不同的組織中廣泛分布，能明顯提高細胞膜對水的通透，促進水的分泌、攝取和維持細胞內(nèi)外水的均衡，多種病理因素引起的組織水腫已被證明與其關(guān)系密切相關(guān)。 作為含水量最多的人體器官，眼許多的生理功能都仰仗迅速、高效的水轉(zhuǎn)運體系，水通道蛋白在其中起著十分重要的作用，包括參與房水循環(huán)、及維持角膜、晶狀體的脫水狀態(tài)等。縱觀視網(wǎng)膜上的各亞型水通道蛋白，AQPl含量最高，主要表達于無長突細胞、色素上皮細胞和光感受器細胞，但它的具體作用還不明確。 既往研究表明AQPs與血腦屏障的通透性密切相關(guān)，對調(diào)節(jié)腦內(nèi)水平衡有重要作用。大腦神經(jīng)中樞向外部分延伸為視網(wǎng)膜視神經(jīng)，血視網(wǎng)膜外屏障和血腦屏障有很多的相似性：二者在極性蛋白的表達，轉(zhuǎn)運功能，通透性方面有著驚人的相似處。因此，在視網(wǎng)膜組織中廣泛存在的AQP1極有可能參與血視網(wǎng)膜外屏障的通透性的調(diào)節(jié)，并在激光損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜水腫中發(fā)揮重要作用。 本研究擬在建立大鼠視網(wǎng)膜激光損傷模型基礎(chǔ)上采用免疫組化、Western-blot分析和RT－PCR技術(shù)確定AQP1在視網(wǎng)膜組織細胞中的表達及分布特征。體外對人RPE細胞進行培育，觀察色素上皮細胞中AQP1的表達及變化；創(chuàng)建激光照射體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞模型，觀測激光損傷對色素上皮細胞中AQP1表達的影響。從而探討AQP1在激光所致視網(wǎng)膜水腫形成發(fā)展中的作用，并探討其相關(guān)機制，以期為利用水通道蛋白作為藥物靶點對激光視網(wǎng)膜損傷進行有效的治療和預(yù)防提供一個新的研究方向和理論依據(jù)。 目的 1、體外建立人的視網(wǎng)膜色素上皮細胞的培養(yǎng)方法； 2、觀察體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)色素上皮細胞上AQP-1的表達； 3、觀察激光照射后，體外培育的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中AQP-1表達的變化； 4、觀察鼠視網(wǎng)膜中AQP-1的表達在激光照射后發(fā)生的變化。 方法 1、視網(wǎng)膜激光損傷模型的建立。 視網(wǎng)膜激光損傷模型的建立方法：單眼充分散瞳，眼前放蓋玻片接觸角膜，進行散瞳眼視網(wǎng)膜激光光凝，每只眼在視盤1.5－2個視盤直徑外4個象限均勻光凝50個點。氬激光參數(shù)設(shè)置：波長532納米，曝光時間0.1秒，光斑光斑為50um，能量100mw，正常眼為對照分析。 2、體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞： 選取新鮮的健康人角膜移植供體眼球，用生理鹽水+慶大霉素沖洗人眼球，剪刀剔除眼外結(jié)締組織。在角膜緣后約1-2mm處剪刀環(huán)形切開，并依次清除角膜，虹膜，晶體，玻璃體及視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，暴露出視網(wǎng)膜色素上皮層。用D-Hank’s液沖洗后節(jié)眼杯2遍，0.25%胰蛋白酶37.5℃消化半小時×2次，得到視網(wǎng)膜色素上皮細胞懸液，加入新鮮胎牛血清終止消化，收集懸液以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘×2次后得到視網(wǎng)膜色素上皮細胞，滴加含有20%胎牛血清的D-F12培養(yǎng)液，接種到25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。用反復(fù)貼壁法純化該細胞。 3、激光損傷體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞模型的建立。 選取第4-5代培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞，復(fù)蘇后按1×105細胞密度接種于6孔板中，放置含5%CO2、95%空氣、濕度為90%的37.5℃孵箱中孵育，第二天，觀察到貼壁生長的細胞，伸出偽足，呈不規(guī)則狀。4-5天后孔板中的細胞基本融合呈一單細胞層，吸凈培養(yǎng)液，垂直置于視網(wǎng)膜激光分離儀前進行激光照射損傷，激光照射后按照損傷后即刻、12小時、24小時、72小時及正常細胞5個不同時間點收集細胞，細胞離心后，去除上清液，收集細胞沉淀放置-80℃深低溫冰箱中保存。氬激光參數(shù)設(shè)置：波長532納米，功率150mw，直徑100um，曝光時間0.15s。 4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(亦稱免疫組化法)、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白免疫印跡（Western Blot）法觀察激光損傷后不同時間鼠視網(wǎng)膜中AQP1的分布及其mRNA和蛋白表達的變化。 5、應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法觀察激光損傷后不同時間體外培育的人RPE細胞中AQP-1表達的變化。 結(jié)果 1、人視網(wǎng)膜色素上皮細胞形態(tài)特征 原代的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞在48-72小時后基本上能夠貼壁呈扁平生長，部分伸出偽足，呈不規(guī)則多角形狀，倒置顯微鏡下看不清細胞核，胞漿中含有豐富的黑色素顆粒，1周左右，貼壁的細胞基本融合形成一單細胞層，可見圓形的細胞核，細胞胞質(zhì)內(nèi)富含黑色素顆粒。每傳代一次，胞質(zhì)中的黑色素逐漸變淡，至第6代左右，細胞趨于透明。 2、激光照射體外培養(yǎng)人RPE細胞后不同時間AQP-1的表達特征 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，，正常組細胞中AQP1mRNA表達量(CtAQP1/CtGAPDH)為：24.63±0.15，激光損傷組分別為：即刻：25.75±0.35，激光損傷后12小時：25.82±0.10，激光損傷后24小時：25.67±0.19，激光損傷后72小時：25.19±0.12，與正常組相比，激光損傷即刻、12小時、24小時及72小時均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)。激光損傷72小時組與激光損傷即刻、12小時及24小時組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。 3、激光照射損傷鼠視網(wǎng)膜中AQP-1的表達特征 免疫組化染色檢測鼠眼視網(wǎng)膜組織，神經(jīng)節(jié)細胞層與內(nèi)核層細胞均出現(xiàn)陽性的棕色粗大顆粒，揭示AQP-1在眼視網(wǎng)膜組織內(nèi)在這兩個部位呈陽性表達。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，正常組AQP1mRNA表達量為：1.15±0.01，激光損傷即刻：1.10±0.01，12小時：1.10±0.03，24小時：1.16±0.01，72小時：1.13±0.01。與正常對照組比較，激光損傷即刻(p=0.0010.05)與激光損傷12小時（p=0.001）有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot結(jié)果顯示： AQP-1的表達在激光損傷后即刻組（1.25±0.35，p=0.04），12小時組（1.06±0.33，p=0.17），24小時組（1.87±0.38，p=0.00），72小時組（1.15±0.36，p=0.09），與正常組視網(wǎng)膜中AQP1的表達（0.73±0.17）統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，激光損傷后即刻組和24小時組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。 結(jié)論 1、激光損傷條件下，RPE中AQP-1mRNA的表達呈動態(tài)改變，即在激光損傷初期呈上調(diào)，至損傷后12小時達到最大值，后期隨著時間的延長呈下調(diào)表達。 2、激光損傷條件下，體內(nèi)視網(wǎng)膜中AQP-1蛋白的表達呈動態(tài)改變，在激光損傷初期表達上調(diào)，至損傷后24小時達到最大值，后隨著時間的延長表達下調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：水通道蛋白-1(AQP-l) 激光損傷 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 動物模型
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 主要英文縮略詞注釋14-15
• 前言15-16
• 第一部分 體外原代純化培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞及定量檢測激光損傷色素上皮細胞中 AQP1 的表達及其分布特征16-34
• 目的16-17
• 一、材料及方法17-24
• 二、結(jié)果24-28
• 三、討論28-32
• 四、小結(jié)32
• 參考文獻32-34
• 第二部分 激光損傷后不同時間點鼠視網(wǎng)膜中 AQP1 的表達34-50
• 目的34
• 一、材料和方法34-41
• 二、結(jié)果41-44
• 三、討論44-47
• 四、小結(jié)47-48
• 參考文獻48-50
• 全文總結(jié)和展望50-51
• 綜述51-59
• 參考文獻56-59
• 在讀期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60

【參考文獻】

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本文編號：692124