本文關(guān)鍵詞：非角化型鼻咽癌分子分型及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

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【摘要】：研究背景和目的 癌癥是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病。臨床上具有相似相近分期分型的癌癥患者對于治療的反應(yīng)存在差異,預(yù)后情況也參差不齊�；诨虮磉_(dá)譜的分子分型在多種腫瘤中已有報道。同一種腫瘤的不同分子亞型的預(yù)后情況,對藥物治療的反應(yīng),對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的偏好等等都存在差異。對不同分子亞型可能需要采取不同的治療方案。鼻咽癌是一種在東南亞地區(qū)高發(fā)的癌癥,主要為非角化型鱗癌。鼻咽癌在臨床上的表現(xiàn)具有異質(zhì)性。目前,以鼻咽癌分子亞型為主題的研究尚未見報道。盡管有研究認(rèn)為鼻咽癌中不存在分子亞型,但是本課題組認(rèn)為：該研究使用了較早版本的芯片注釋文件,探針集的注釋可能存在較多的錯誤；另外,該研究的聚類分析是基于芯片上所有的的探針集,受噪聲影響可能較大。目前,公共數(shù)據(jù)庫中可利用的鼻咽癌基因表達(dá)譜有56例,本研究新增25例,這為鼻咽癌分子分型提供了條件。如果能夠確認(rèn)鼻咽癌分子亞型的存在,很有可能對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展提供新的認(rèn)識,對診斷與治療起到指導(dǎo)作用。 方法 1.基因芯片數(shù)據(jù) 本研究主要分析了三組不同來源的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。其中部分?jǐn)?shù)據(jù)下載自公共數(shù)據(jù)庫GEO,包括GSE12452(31例鼻咽癌及10例正常鼻咽上皮組織)和GSE13597(25例鼻咽癌及3例正常鼻咽上皮組織)。此外,本課題組新增了25例鼻咽癌及8例正常鼻咽上皮組織的芯片數(shù)據(jù)。 此外,EB病毒編碼基因在GSE12452中31例鼻咽癌組織的表達(dá)情況(QRT-PCR數(shù)據(jù)來自原作者)也被納入我們的分析。 2.聚類分析 我們采用了無監(jiān)督等級聚類算法(unsupervised hierarcahical clustering),自組織圖聚類算法(self-organized map), K-means聚類算法分別對GSE12452的41例芯片數(shù)據(jù)和GSE13597的28例芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析。 3.篩選差異表達(dá)基因及標(biāo)簽基因的比較 我們首先比較了亞型之間的基因表達(dá)譜,用SAM算法對每個基因之間差異表達(dá)的顯著程度進(jìn)行了評估。我們還將各個鼻咽癌分子亞型單獨(dú)與正常鼻咽上皮基因表達(dá)譜用SAM算法進(jìn)行比較。 4.基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis) 我們使用基因集富集分析(GSEA)對鼻咽癌亞型之間的生物學(xué)差異進(jìn)行了比較。在分析之前將表達(dá)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成GSEA軟件能識別的格式,并將基因表達(dá)值轉(zhuǎn)換成線性值(linear-scale)。我們使用了GSEA提供的來自已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)千個標(biāo)簽基因集進(jìn)行分析。 5.鼻咽癌分子亞型基因預(yù)測器的構(gòu)建 構(gòu)建分子亞型預(yù)測器使用的是經(jīng)過Combat處理的GSE12452與GSE13597數(shù)據(jù)集。本分析使用了Gene Pattern平臺中的WeightedVotingXValidation以及WeightedVoting模塊。首先以GSE12452為訓(xùn)練集(31例樣本),每次取出一例樣本,根據(jù)剩余的30例樣本,篩選出50個預(yù)測器基因(此過程即為交叉驗(yàn)證,cross-validation),并用于對預(yù)先排除在外的樣本的類別歸屬進(jìn)行判定。挑選在所有31輪預(yù)測中均被選中的基因,得到一個基因列表,此分析由WeightedVotingXValidation模塊完成。作為驗(yàn)證,再將上述所得基因作為預(yù)測器,使用WeightedVoting模塊中對GSE13597中的鼻咽癌樣本類別歸屬進(jìn)行預(yù)測。 6.轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 我們使用軟件ARACNe構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。首先將91例芯片數(shù)據(jù)整合然后用combat軟件處理批次效應(yīng)。從數(shù)據(jù)庫animalTFDB下載轉(zhuǎn)錄因子列表。在ARACNe分析之前,對基因根據(jù)其表達(dá)值的變異程度進(jìn)行了篩選,只保留具有一定波動的基因。在ARACNe分析中,選用了高斯核估計(Gaussian kernel estimator)用于交互信息的計算,并將MI值的閾值設(shè)置為p值不超過0.05,對DPI分析的容忍度設(shè)置為0%。為了使MI值的估算更加準(zhǔn)確,做了100次的自舉(bootstrap),并通過一致性投票(consensus voting)確定最終的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。采用fisher精確性檢驗(yàn)評估各個轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測靶基因與鼻咽癌分子亞型標(biāo)簽基因之間的重疊是否具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。 7.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 我們將鼻咽癌亞型標(biāo)簽基因提交到網(wǎng)站STRING,提取標(biāo)簽基因蛋白產(chǎn)物之間的相互作用關(guān)系。為了驗(yàn)證在標(biāo)簽基因之間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用是否是隨機(jī)出現(xiàn)的,我們還隨機(jī)抽取了1000組相同數(shù)目的基因上傳到STRING作為對照。 8.競爭內(nèi)源性RNA (ceRNA)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 我們首先從數(shù)據(jù)庫starbase下載了microRNA與靶基因的作用對。參考了Pandolfi等人工作的方法,我們構(gòu)建了一個競爭內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò),并提取鼻咽癌亞型標(biāo)簽基因之間的ceRNA關(guān)系。 9.藥物預(yù)測 我們使用在線生物信息學(xué)工具連接圖譜(connectivity map)對鼻咽癌亞型的標(biāo)簽基因進(jìn)行了分析,將藥物的標(biāo)簽基因表達(dá)模式與鼻咽癌亞型的標(biāo)簽基因表達(dá)模式進(jìn)行比較,從而預(yù)測可能對鼻咽癌起治療作用的藥物。 結(jié)果 1.鼻咽癌分子亞型及其生物學(xué)差異 基于上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中存在至少兩種分子亞型。該分型與TNM分期無關(guān)。Ⅰ型鼻咽癌表達(dá)譜與正常鼻咽組織接近�；蚣患治霭l(fā)現(xiàn)Ⅰ型鼻咽癌可能呈現(xiàn)免疫反應(yīng)顯著,病毒載量低,細(xì)胞增生和腫瘤干細(xì)胞富集程度可能較低,轉(zhuǎn)移能力可能較低,預(yù)后可能較好；Ⅱ型鼻咽癌可能呈現(xiàn)免疫反應(yīng)缺失,病毒載量高,細(xì)胞增生和腫瘤干細(xì)胞富集程度可能較高,轉(zhuǎn)移能力可能較強(qiáng),預(yù)后可能較差。在將兩種亞型單獨(dú)與正常鼻咽上皮基因表達(dá)譜比較的基礎(chǔ)上,我們推測Ⅱ型鼻咽癌可能是工型鼻咽癌受到EB病毒載量增加的影響,發(fā)展惡化所得。一共有29個基因被選中作為鼻咽癌亞型的預(yù)測基因。 2.鼻咽癌分子亞型轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 我們將轉(zhuǎn)錄因子按照其調(diào)控的鼻咽癌亞型標(biāo)簽基因數(shù)量排序,靶基因與Ⅰ型標(biāo)簽基因顯著重疊的轉(zhuǎn)錄因子中,前四位轉(zhuǎn)錄因子SP140, IRF8,KLF2和STAT4一共調(diào)控了69%Ⅰ型鼻咽癌標(biāo)簽基因；靶基因與Ⅱ型標(biāo)簽基因顯著重疊的轉(zhuǎn)錄因子中,前六位轉(zhuǎn)錄因子KLF2, DNAJC2, FOXM1, HMGB2, MYC和ZNF146一共調(diào)控了70%Ⅱ型的鼻咽癌標(biāo)簽基因。 3.鼻咽癌分子亞型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 我們發(fā)現(xiàn)158/327個Ⅱ型標(biāo)簽基因參與了249對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,117/351個Ⅰ型標(biāo)簽基因參與了222對蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)相互作用。在1000次隨機(jī)抽取相同數(shù)量基因所得的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中,平均有42/327個隨機(jī)抽取基因參與了30對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,以及平均有43/351個隨機(jī)抽取基因參與了31對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。其中,CDK1與25個Ⅱ型標(biāo)簽基因有相互作用,是Ⅱ型網(wǎng)絡(luò)中的樞紐。 4.鼻咽癌分子亞型競爭內(nèi)源性R,NA網(wǎng)絡(luò) 我們構(gòu)建了一個由1506個基因及48338個相互作用組成的無向ceRNA網(wǎng)絡(luò)。22個Ⅱ型標(biāo)簽基因參與了38對相互作用,其中,WEEl參與了20對相互作用,是Ⅱ型鼻咽癌ceRNA網(wǎng)絡(luò)的樞紐。 5.鼻咽癌治療藥物的預(yù)測 Thioridazine是一種已知的多巴胺受體拮抗劑,已被作為抗精神病藥物。連接圖譜分析預(yù)測其可能具有針對Ⅱ型鼻咽癌的治療作用。 結(jié)論 通過對81例非角化型鼻咽癌和21例正常鼻咽上皮組織的基因表達(dá)譜,以及EB病毒編碼基因的QRT-PCR數(shù)據(jù)的分析,我們發(fā)現(xiàn)非角化型鼻咽癌可以分為(至少)兩類。Ⅰ型鼻咽癌有較低的EBV載量,可能有較強(qiáng)的免疫相應(yīng)和較好的臨床預(yù)后。Ⅱ型鼻咽癌有較高的EBV載量,可能呈現(xiàn)免疫逃逸的狀態(tài),可能具有較強(qiáng)的增殖趨勢和較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險,可能具有較高的腫瘤干細(xì)胞含量。總體上,Ⅱ型鼻咽癌的惡性程度較高,而這種情況可能是由EBV的載量引起的。這也就解釋了為什么血清EBV/DNA抗體滴度是目前非角化型鼻咽癌在臨床上早期診斷唯一有效的標(biāo)志物,也提示了抗病毒治療在非角化型鼻咽癌中可能具有的前景。 我們對亞型的標(biāo)簽基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及競爭內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò),這些結(jié)果表明鼻咽癌分子亞型的標(biāo)簽基因不是一個隨機(jī)出現(xiàn)的結(jié)果,而是作為一個整體以一種網(wǎng)絡(luò)的方式共同參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展并且塑造了兩種亞型的生物學(xué)特點(diǎn)。這些分子網(wǎng)絡(luò)中的樞紐,比如CDK1, FOXMl以及WEE1等等,都可能在今后作為鼻咽癌治療的重要靶點(diǎn),值得進(jìn)一步的研究。而我們預(yù)測的藥物,Thioridazine,也值得進(jìn)一步考察其是否對鼻咽癌具有治療功能。 我們必須承認(rèn),本研究具有一定的局限性：1)缺乏臨床預(yù)后數(shù)據(jù)的支持,無法明確所得鼻咽癌分子亞型是否有預(yù)后上的差異。2)缺乏實(shí)驗(yàn)的支持,無法驗(yàn)證所構(gòu)建的各個分子網(wǎng)絡(luò)的樞紐基因在鼻咽癌中具體的生物學(xué)意義,同時,也無法排除樣本中所含有的非癌組織對分型的影響。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 分子分型 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 競爭內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-16
• 第一章 鼻咽癌分子分型及其分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建16-49
• 一、鼻咽癌分子分型及其生物學(xué)差異16-37
• 二、鼻咽癌分子亞型分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析37-43
• 三、鼻咽癌分子亞型藥物預(yù)測43-49
• 第二章 討論49-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 附圖56-65
• 附錄65-69
• 致謝69-70

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本文編號：681185