本文關(guān)鍵詞：骨橋蛋白誘導(dǎo)角膜新生血管形成機(jī)制的實驗研究

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【摘要】：目的通過骨橋蛋白(OPN)對角膜成纖維細(xì)胞(CFs)與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)模型作用的實驗研究,來揭示OPN誘導(dǎo)角膜新生血管形成的相關(guān)因子及作用通路,為進(jìn)一步研究微環(huán)境變化對OPN誘導(dǎo)角膜新生血管的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法1、遵從倫理學(xué)規(guī)定,基質(zhì)透鏡取材于剛剛完成屈光手術(shù)的患者。應(yīng)用組織塊法對飛秒激光角膜屈光手術(shù)獲得角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行培養(yǎng),獲得培養(yǎng)細(xì)胞。通過光鏡觀察、HE染色及免疫組織化學(xué)染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為角膜成纖維細(xì)胞。應(yīng)用Transwell培養(yǎng)小室系統(tǒng)建立CFs與HUVECs共培養(yǎng)模型。2、實驗分為兩大組：CFs與HUVECs共培養(yǎng)組、HUVECs單獨培養(yǎng)組。兩組培養(yǎng)24h后,分別加入PI3K/AKT抑制劑LY294002、ERK1/2抑制劑PD98059、骨橋蛋白抗體、抗整合素anti-αvβ3抗體,anti-VEGF抗體,30min后用骨橋蛋白誘導(dǎo)活化。孵育24h后,應(yīng)用光鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移情況；應(yīng)用ELISA、Real-timePCR、Western-blot觀察VEGF mRNA及蛋白水平；應(yīng)用Western-blot觀察ERK1/2、PI3K/AKT磷酸化情況。結(jié)果1、培養(yǎng)飛秒激光角膜屈光手術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡。當(dāng)培養(yǎng)至第5天,組織塊周圍出現(xiàn)放射狀細(xì)胞爬出,第9天能夠爬滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞呈長梭形,貼壁生長,多聚集在組織塊周圍,魚群樣,可以重疊生長。HE染色：細(xì)胞呈梭形或多角形,核仁明顯,橢圓形,呈藍(lán)色；細(xì)胞胞體較大,細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色：Vimentin(+); Desmin (-)、S-100(-)、Keratin (-)。2、應(yīng)用Transwell小室系統(tǒng),將內(nèi)皮細(xì)胞接種在上室,角膜成纖維細(xì)胞接種在下室,單獨培養(yǎng)24h后將兩者套疊在一起。成功建立CFs與HUVECs共培養(yǎng)模型。3、CFs與HUVECs共培養(yǎng)24h,將上室細(xì)胞用棉拭子擦去；以1%甲醛溶液固定下層細(xì)胞；0.5%結(jié)晶紫染色,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組下層細(xì)胞平均在121個,明顯多于單獨培養(yǎng)組。4、ELISA檢驗中,兩實驗組加入OPN后VEGF表達(dá)增高,共培養(yǎng)組高于單獨培養(yǎng)組。加入抑制劑、抗體后各實驗孔VEGF的濃度有下降(除anti-VEGF孔外,p均0.05),OPN抗體、anti-αvβ3抗體孔VEGF下降最明顯。共培養(yǎng)組中各孔均高于單獨培養(yǎng)組,但差異不明顯。熒光定量檢測實驗中,OPN誘導(dǎo)共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組VEGF表達(dá)都明顯升高,共培養(yǎng)組明顯高于單獨培養(yǎng)組。在共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組,加入各種抗體VEGF表達(dá)都下降。與OPN對照,OPN抗體、PI3K/AKT抑制劑、ERK1/2抑制劑試驗孔VEGF表達(dá)均明顯下降,OPN抗體和anti-αvβ3抗體作用最明顯。共培養(yǎng)在各藥物組VEGF均值均高于單獨培養(yǎng)組。5、Western blot實驗中,OPN共培養(yǎng)組VEGF蛋白表達(dá)明顯高于于單獨培養(yǎng)組(p0.05)。在共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組,加入各種抗體VEGF表達(dá)均明顯下降(p0.05)。與OPN對照,OPN抗體試驗孔下降最明顯。同時發(fā)現(xiàn)OPN誘導(dǎo)共培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組ERK1/2、PI3K/AKT在0.5h有明顯磷酸化,共培養(yǎng)組高于單獨培養(yǎng)組(p0.05)。OPN抗體與抗整合素anti-αvβ3抗體試驗孔磷酸化均為檢出。結(jié)論1.飛秒激光角膜屈光手術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡是角膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的可靠組織來源。2.OPN通過CFs與HUVECs相互作用模型誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移明顯,單獨誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移不明顯。3.CFs與HUVECs共培養(yǎng)模型在OPN能夠誘導(dǎo)下VEGF的表達(dá)高于HUVECs單獨培養(yǎng)組,CFs在VEGF表達(dá)中具有一定的作用,是潛在的抗新生血管的靶細(xì)胞。4、OPN通過ERK1/2、PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)CFs與HUVECs共培養(yǎng)模型VEGF表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成。
【關(guān)鍵詞】：骨橋蛋白 角膜成纖維細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 角膜新生血管 飛秒激光角膜屈光手術(shù)
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 中英文縮寫對照10-11
• 前言11-12
• 第一部分 實驗 OPN對CFs與HUVECs相互作用模型中內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響及鑒定12-18
• 材料與方法12-14
• 結(jié)果14-16
• 討論16-18
• 結(jié)論18
• 第二部分 實驗 OPN對CFs與HUVECs相互作用機(jī)制實驗研究18-29
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-29
• 結(jié)論29
• 參考文獻(xiàn)29-33
• 文獻(xiàn)綜述 骨橋蛋白與眼部新生血管性疾病的相關(guān)研究進(jìn)展33-39
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 碩士期間發(fā)表的文章39-40
• 研究生期間參與的課題40
• 參加學(xué)術(shù)會議40
• 研究生期間所獲得的獎勵40-41
• 致謝41-43

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 沈陽;周行濤;;飛秒激光輔助的角膜透鏡植入技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國眼耳鼻喉科雜志;2012年04期

2 姜宏;許海洋;郝繼龍;;人角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌作用與脂多糖的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年28期

3 王s，

本文編號：673432