發(fā)布時(shí)間：2017-07-05 16:28

  本文關(guān)鍵詞：攜帶Ang-1基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型小鼠的干預(yù)研究

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【摘要】：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（Retinopathy of premature，ROP）是早產(chǎn)兒比較常見的眼部疾病，主要由于現(xiàn)在醫(yī)療水平的提高及圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,使早產(chǎn)兒存活率大幅度升高，尤其是對小胎齡兒及低出生體重兒存活率不斷增加，使ROP的發(fā)生概率也呈現(xiàn)上升趨勢。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的機(jī)理為視網(wǎng)膜的增生，最終因視網(wǎng)膜纖維組織的增生產(chǎn)生牽拉視網(wǎng)膜組織，最終導(dǎo)致失明的嚴(yán)重后果，因此現(xiàn)成為眼科及新生兒科極其關(guān)注的重點(diǎn)，同時(shí)引起了眾多學(xué)者的探索。但其具體發(fā)病機(jī)制不詳。本文章則從ROP存在明顯血管增生異常著手，首先應(yīng)用新生幼鼠構(gòu)建ROP動(dòng)物模型，再通過應(yīng)用轉(zhuǎn)染促血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stemcells，MSCs），在不同的生長時(shí)間點(diǎn)輸注至模型鼠的體內(nèi)，通過觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、HE染色、免疫組化及qRT-PCR方法了解轉(zhuǎn)染攜帶基因的細(xì)胞后，視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及Ang1的表達(dá)情況，主要目的在于討論攜帶Ang-1基因的MSCs對于ROP新生血管的影響及作用效果，為以后ROP在細(xì)胞治療方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為臨床研究探討早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變提供研究支持及基礎(chǔ)資料。本實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)部分。 第一部分：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型動(dòng)物的構(gòu)建 本部分主要選取新生昆明小鼠，雌雄不限制，隨機(jī)分兩組，分別在空氣及高氧下飼養(yǎng)，選取生后17日處死，應(yīng)用改良的明膠墨汁自小鼠心臟灌注，后取材視網(wǎng)膜鋪片，觀察空氣組和高氧組下眼底視網(wǎng)膜血管的增生、變化情況；同時(shí)應(yīng)用Image-proplus6.0處理軟件，計(jì)算兩組視網(wǎng)膜周邊血管的生成率，應(yīng)用SPSS軟件，查看其是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)取眼球行石蠟包塊、切片、HE染色，觀察兩種情況下視網(wǎng)膜細(xì)胞層的形態(tài)變化及突出視網(wǎng)膜內(nèi)界膜新生血管的細(xì)胞核數(shù)目。綜合兩點(diǎn)明確該氧誘導(dǎo)ROP動(dòng)物模型是成功的。 第二部分：攜帶Ang-1基因的MSCs對小鼠ROP模型的干預(yù)及影響 本部分首先是MSCs的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)及凍存過程，在此過程中掌握關(guān)于MSCs的基本培育及保存技術(shù)，是本實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵，同時(shí)借助于本實(shí)驗(yàn)課題組李秋平老師進(jìn)行的病毒轉(zhuǎn)載Ang-1基因移入MSCs中，并應(yīng)用DsRed(Red fluorescent protein fromDiscosoma Sp)熒光蛋白技術(shù)及單克隆法篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，后注入模型鼠體內(nèi)，為下一步干預(yù)治療做準(zhǔn)備。并利用（65%±5%）持續(xù)吸氧的方法，成功制成小鼠的ROP模型。通過明膠墨汁視網(wǎng)膜灌注觀察其形態(tài)學(xué)、HE染色、免疫組化及qRT-RNA，進(jìn)一步查看視網(wǎng)膜血管發(fā)育變化及Ang-1的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，與空氣對照組比較，高氧組視網(wǎng)膜血管走形紊亂，有管腔堵塞所致的無血液充盈區(qū)；同時(shí)通過HE染色提示高氧組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列均較亂，且有新生血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)界膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在持續(xù)高氧環(huán)境下，注入Ang-1+MSCs和單純MSCs不管在視網(wǎng)膜血管形態(tài)，還是促進(jìn)Ang-1表達(dá)上均有優(yōu)化及促進(jìn)作用，對視網(wǎng)膜異常血管有一定修復(fù)功能；且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得知，無論從觀察視網(wǎng)膜鋪片后的形態(tài)還是HE染色的，Ang-1+MSCs注入組效果明顯好于MSCs組，提示前兩者之間在調(diào)節(jié)血管生成方面有協(xié)同作用。
【關(guān)鍵詞】：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜眼底病變 促血管生成素-1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 視網(wǎng)膜新生血管 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 前言10-11
• 第一部分 高氧誘導(dǎo)新生兒 ROP 模型的建立11-21
• 一、 材料與儀器11-13
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法13-14
• 三、 新生鼠 ROP 模型建立效果14-17
• 四、 討論17-20
• 五、 參考文獻(xiàn)20-21
• 第二部分 攜帶 Ang-1 基因的骨髓 MSCs 對 ROP 模型鼠干預(yù)研究21-46
• 一、 小鼠 MSCs 的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)及凍存23-24
• 二、 攜帶 ANG-1 基因的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠 MSCs24
• 三、 小鼠 MSCs 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)、凍存及轉(zhuǎn)染基因后結(jié)果觀察24-25
• 四、 細(xì)胞治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段25-40
• (一) 材料與設(shè)備25-27
• (二) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法27-28
• (三) 檢測方法28-34
• (四) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-40
• 五、 討論40-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 文獻(xiàn)綜述46-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 在讀期間的成果53-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：522768