本文關(guān)鍵詞：結(jié)膜下注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠角膜移植排斥作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 角膜移植是許多不可逆角膜損傷及某些先天性角膜病變患者脫盲的唯一治療途徑,角膜移植排斥反應(yīng)是影響角膜植片存活及高危角膜移植失敗的最主要原因。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞)增殖和功能的作用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),鼠尾靜脈注射MSCs可以抑制角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生,延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間。在此基礎(chǔ)上,本研究仍采用大鼠同種異體大鼠角膜移植排斥動(dòng)物模型,通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)膜下注射MSCs,觀察MSCs對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的影響,并初步研究MSCs抑制角膜移植排斥反應(yīng)的可能調(diào)控機(jī)制,為MSCs治療角膜移植排斥反應(yīng)探索新的方法和途徑。 方法 1.原代培養(yǎng)Wistar大鼠MSCs,達(dá)90%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表型,并做體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。第3代細(xì)胞以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。 2.制作大鼠角膜移植動(dòng)物模型,隨機(jī)分為4組。 A組：對(duì)照組,給予等量不含藥物的PBS。 B組：術(shù)前結(jié)膜下注射MSCs治療組。 C組：術(shù)后一次結(jié)膜下注射MSCs治療組。 D組：術(shù)后兩次結(jié)膜下注射MSCs治療組。 裂隙燈下對(duì)角膜植片進(jìn)行臨床觀察,以混濁、水腫和新生血管3項(xiàng)指標(biāo)作為臨床評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),比較各組角膜植片的平均存活時(shí)間。 3.角膜移植模型建立后10天,收集A、D組大鼠右側(cè)眼球(術(shù)眼),進(jìn)行角膜組織病理HE染色和免疫組織化學(xué)CD4+T細(xì)胞染色。 4.角膜移植模型建立后第7天、10天,分別收集A、D組大鼠角膜組織提取總RNA,實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的表達(dá)情況。5.角膜移植模型建立后第10天,分別收集A、D組角膜組織,角膜組織提取總蛋白,采用ELISA試劑盒檢測(cè)角膜組織中細(xì)胞因子IL-4、IL-10的分泌情況。 結(jié)果 1.成功分離、培養(yǎng)并鑒定了MSCs, MSCs呈間質(zhì)細(xì)胞特性：梭形,漩渦狀排列。茜素紅染色、油紅染色貼壁細(xì)胞分別呈骨樣細(xì)胞及脂肪樣細(xì)胞分化。 2.成功建立大鼠角膜移植動(dòng)物模型。 3.結(jié)膜下注射MSCs治療角膜移植術(shù)后大鼠,術(shù)前MSCs注射組(B組)(8.0±0.9)天較對(duì)照組(A組)(9.8±1.2)天縮短了植片存活時(shí)間(p0.05)；術(shù)后一次注射MSCs治療組(C組)(10.8±1.3)天與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；術(shù)后兩次注射MSCs治療組(D組)角膜植片的存活時(shí)間(12.6±1.4)天與A組相比顯著延長(zhǎng)(p0.05)。 4.角膜移植術(shù)后10天,角膜組織HE染色結(jié)果顯示,A組角膜植片水腫、增厚,可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),大量新生血管、淋巴管存在。免疫組化可見(jiàn)大量CD4+T細(xì)胞在角膜植床和植片基質(zhì)內(nèi)。D組角膜植片輕度水腫,基質(zhì)輕度增厚,少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分新生血管、淋巴管長(zhǎng)入。CD4+T細(xì)胞散在分布,浸潤(rùn)程度較A組減輕。 5. Real-time PCR結(jié)果顯示,角膜移植術(shù)后7天,D組大鼠角膜植片中IFN-γ的mRNA表達(dá)水平較A組降低(p0.05),Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10的mRNA水平升高(p0.05)；術(shù)后10天,D組大鼠角膜植片中IL-4、IL-10的mRNA水平仍顯著升高(p0.05),但Thl細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2的表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)(p0.05)。 6.角膜組織ELISA結(jié)果顯示,角膜移植術(shù)后10天,D組角膜植片中IL-10的含量較A組及正常組顯著增高(p0.05)；IL-4的蛋白絕對(duì)含量較低,且各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論 結(jié)膜下注射MSCs可以延長(zhǎng)大鼠同種異體穿透性角膜移植植片的存活時(shí)間,抑制免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。這一作用可能是通過(guò)抑制CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答和浸潤(rùn)、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡,特別是上調(diào)Th2細(xì)胞因子IL-10而介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：角膜移植 細(xì)胞治療 免疫排斥反應(yīng) 間充質(zhì)干細(xì)胞 Th1/Th2
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R779.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• ~.略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料14-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器和設(shè)備14-15
• 1.1.3 主要試劑及溶液配制15-16
• 1.2 方法16-25
• 1.2.1 MSCs原代培養(yǎng)16
• 1.2.2 MSCs傳代、純化和擴(kuò)增16
• 1.2.3 MSCs的凍存與復(fù)蘇16-17
• 1.2.4 MSCs的鑒定17-18
• 1.2.5 角膜移植動(dòng)物模型制備18-19
• 1.2.6 動(dòng)物模型的分組與治療19
• 1.2.7 臨床觀察及評(píng)分19-20
• 1.2.8 角膜植片組織病理學(xué)染色20
• 1.2.9 角膜組織免疫組織化學(xué)染色20-21
• 1.2.10 角膜組織總RNA提取21
• 1.2.11 角膜組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄21-22
• 1.2.12 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)22-23
• 1.2.13 角膜組織總蛋白的提取23-24
• 1.2.14 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌24-25
• 1.2.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理25
• 1.3 結(jié)果25-32
• 1.3.1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定25-26
• 1.3.2 角膜移植術(shù)后臨床觀察情況26-27
• 1.3.3 大鼠角膜植片存活情況比較27-28
• 1.3.4 角膜植片HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果28-29
• 1.3.5 角膜植片Th1、Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較29-31
• 1.3.6 角膜植片中細(xì)胞因子IL-4、IL-10蛋白含量的比較31-32
• 1.4 討論32-39
• 1.4.1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定32-33
• 1.4.2 MSCs的輸注途徑33-34
• 1.4.3 MSCs的輸注時(shí)間34-35
• 1.4.4 MSCs的輸注劑量35
• 1.4.5 MSCs的免疫學(xué)特點(diǎn)和免疫抗炎作用35-36
• 1.4.6 MSCs對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的抑制作用36
• 1.4.7 MSCs調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞36-37
• 1.4.8 MSCs上調(diào)IL-1037-38
• 1.4.9 不足之處38-39
• 1.5 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-47
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明47-48
• 綜述48-60
• 綜述參考文獻(xiàn)55-60
• 致謝60

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：444732