本文關(guān)鍵詞：ADMA在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谘暰W(wǎng)膜屏障損傷中的作用及機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,是成人失明的重要病因。血-視網(wǎng)膜屏障損傷和血管新生是DR的主要病理特征。其中,血-視網(wǎng)膜屏障損傷不僅是非增殖性DR(DR分為非增殖性DR和增殖性DR)的重要病理特征,而且是導(dǎo)致非增殖性DR向增殖性DR轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟,因此,減輕或抑制DR血-視網(wǎng)膜屏障損傷對(duì)于DR防治非常重要。但目前仍無有效的措施干預(yù)并延緩糖尿病視網(wǎng)膜微血管屏障損傷的發(fā)生發(fā)展。 非對(duì)稱二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)是內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物,在體內(nèi)主要由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解。我們實(shí)驗(yàn)室和國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者均已證明在糖尿病和糖尿病血管并發(fā)癥時(shí),ADMA水平的升高與血管內(nèi)皮功能紊亂和血管病變密切相關(guān)。然而,有關(guān)DDAH/ADMA與糖尿病血管病變的研究主要集中在外周血管,是否與糖尿病微血管病變有關(guān),報(bào)道甚少。臨床研究發(fā)現(xiàn),DR病人血漿ADMA濃度明顯升高,且其房水中ADMA水平亦顯著增加,提示ADMA可能在DR的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。已知,間隙連接細(xì)胞間通迅(Gap junction intercellular communication, GJIC)功能障礙是DR血-視網(wǎng)膜屏障損傷的重要機(jī)制。間隙連接蛋白蛋白43(Connexin43,Cx43)是構(gòu)成細(xì)胞間隙連接的重要成分。研究表明,高糖可抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞Cx43表達(dá),導(dǎo)致GJIC功能障礙。我室前期研究表明,外源性ADMA可直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞Cx43mRNA表達(dá),損傷GJIC功能�；诖�,我們推測(cè)糖尿病時(shí),ADMA可能通過干預(yù)視網(wǎng)膜周細(xì)胞Cx43表達(dá),影響GIJC功能,進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜微血管屏障損傷。 Eph受體是新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶受體家族的分支。研究報(bào)導(dǎo),EphA2受體參與細(xì)胞透性調(diào)節(jié)。在培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)可通過上調(diào)EphA2信號(hào)通路增加細(xì)胞透性。另外,研究發(fā)現(xiàn),VEGF是DDAH的下游靶點(diǎn),提示糖尿病時(shí),DDAH/ADMA亦可能通過調(diào)節(jié)EphA2信號(hào)通路,影響視網(wǎng)膜微血管屏障功能。 本實(shí)驗(yàn)將在Ⅰ型糖尿病大鼠模型(不同時(shí)期)上觀察ADMA在視網(wǎng)膜組織中的動(dòng)態(tài)變化,確定ADMA與DR早期血-視網(wǎng)膜屏障損傷的內(nèi)在聯(lián)系；在原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞(Retinal pericytes, RPCs)中進(jìn)一步確證DDAH/ADMA在高糖所誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障損傷中的作用,采用siRNA方法觀察內(nèi)、外源性ADMA是否能模擬高糖所誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障損傷,并進(jìn)一步探討DDAH/ADMA對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷的影響是否涉及ADMA/Cx43/GJIC途徑和/或ADMA/EphA2途徑。 方法 單次腹腔注射(60mg/kg) STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常對(duì)照組(二周、四周和八周)與糖尿病大鼠病程組(二周、四周和八周)。檢測(cè)各組大鼠體重、血糖、胰島素水平的變化,伊文思藍(lán)法檢測(cè)大鼠血-視網(wǎng)膜屏障功能,透射電鏡觀察血-視網(wǎng)膜屏障結(jié)構(gòu)的完整性；取大鼠全血,分離血漿,檢測(cè)大鼠ADMA (HPLC法)水平與NO水平(Griess法)；取大鼠房水,檢鋇ADMA水平(HPLC法)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織Cx43和EphA2mRNA和蛋白表達(dá)。 分離、培養(yǎng)和鑒定RPCs。實(shí)驗(yàn)分為三部分：①葡萄糖(30mM)處理RPCs1、3、5、7天；②外源性ADMA (3、10、30μM)、一氧化氮合酶抑制物單甲基精氨酸L-NMMA (30μM)和NO供體硝普鈉(0.1mM)處理RPCs48h;③內(nèi)源性ADMA處理RPCs48h(分為DDAH1siRNA, DDAH2siRNA, DDAH1+2siRNA)。Transwell小室檢測(cè)RPCs透性；Hoechst法與Caspase-3活性檢鋇RPCs凋亡；劃痕(SDLT)法檢測(cè)IRPCs GJIC功能；HPLC法檢測(cè)上清液ADMA水平；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Cx43與p-Cx43蛋白表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RPCs DDAH、Cx43與EphA2mRNA表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞DDAH、Cx43與p-Cx43蛋白表達(dá)。 結(jié)果 I型糖尿病大鼠血糖穩(wěn)定持續(xù)升高,出現(xiàn)明顯“三多”(多飲,多食和多尿)癥狀,且二周、四周和八周糖尿病大鼠的體重、血漿中胰島素水平均較正常對(duì)照組顯著降低,表明建模成功。血-視網(wǎng)膜屏障功能檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組大鼠相比,糖尿病大鼠組視網(wǎng)膜組織通透性均顯著增加,并在八周達(dá)到高峰；同時(shí)大鼠視網(wǎng)膜外周血管相繼出現(xiàn)水腫,細(xì)胞間間隙連接不完整,基底膜增厚,RPCs數(shù)目減少和屏障結(jié)構(gòu)不完整。此外,同對(duì)照組大鼠相比,糖尿病大鼠房水與血漿中ADMA水平顯著升高,視網(wǎng)膜組織Cx43mRNA與蛋白表達(dá)顯著下調(diào),EphA2mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。 在原代培養(yǎng)的RPCs:①高糖可時(shí)間依賴性的增加RPCs透性,誘導(dǎo)RPCs凋亡,第5天達(dá)到顯著差異,第7天更明顯；高糖可顯著增加細(xì)胞上清液ADMA水平,降低Cx43表達(dá),抑制GJIC功能,并上調(diào)EphA2表達(dá)；②外源性ADMA可時(shí)間與劑量依賴性的增加RPCs透性,誘導(dǎo)RPCs凋亡,降低Cx43mRNA與蛋白表達(dá)并上調(diào)EphA2mRNA的表達(dá),L-NMMA也產(chǎn)生類似的作用,NO供體(硝普鈉)可部分逆轉(zhuǎn)ADMA對(duì)RPCs的影響；③采用DDAH siRNA內(nèi)源性增加ADMA水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與外源性ADMA一致,可增加RPCs透性和凋亡,并且DDAH siRNA可加強(qiáng)高糖對(duì)RPCs的影響。 結(jié)論 1、ADMA與DR早期血-視網(wǎng)膜屏障損傷有關(guān)。 2、DDAH/ADMA介導(dǎo)了高糖所誘導(dǎo)的RPCs血-視網(wǎng)膜屏障損傷,其機(jī)制涉及ADMA/Cx43/GJIC途徑和ADMA/EphA2途徑。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 血-視網(wǎng)膜屏障損傷 非對(duì)稱二甲基精氨酸 間隙連接蛋白43 酪氨酸蛋白激酶受體EphA2
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 目錄12-14
• 專業(yè)名詞縮寫中英文對(duì)照表14-15
• 1 前言15-18
• 2 材料與方法18-29
• 2.1 試劑與儀器18-21
• 2.1.1 主要試劑18-20
• 2.1.2 主要儀器20-21
• 2.2 方法21-29
• 2.2.1 動(dòng)物及模型制備21
• 2.2.2 動(dòng)物模型檢測(cè)指標(biāo)21-22
• 2.2.3 RPCs分離與培養(yǎng)22-23
• 2.2.4 血漿、房水與細(xì)胞上清液ADMA水平的測(cè)定23-24
• 2.2.5 細(xì)胞透性功能檢測(cè)方案24
• 2.2.6 RPCs凋亡的測(cè)定24
• 2.2.7 細(xì)胞間通訊功能檢測(cè)—細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)法(SLDT)24-25
• 2.2.8 PCR檢測(cè)DDAH1、DDAH2、Cx43以及EphA2 mRNA表達(dá)25-26
• 2.2.9 Western blot檢測(cè)DDAH1、DDAH2、Cx43和p-Cx43蛋白表達(dá)26-27
• 2.2.10 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)RPCs Cx43以及p-Cx43的表達(dá)27-28
• 2.2.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染28
• 2.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 3 結(jié)果29-34
• 3.1 建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型29
• 3.2 大鼠血－視網(wǎng)膜屏障功能變化29
• 3.3 大鼠視網(wǎng)膜電鏡圖像29
• 3.4 血漿、房水ADMA水平與血漿NO水平變化29
• 3.5 大鼠RPCs鑒定29-30
• 3.6 高糖對(duì)RPCs透性和凋亡功能的影響30
• 3.6.1 高糖對(duì)RPCs透性的影響30
• 3.6.2 高糖對(duì)RPCs凋亡的影響30
• 3.7 高糖對(duì)RPCs分泌ADMA和NO的影響30
• 3.8 外源性ADMA對(duì)RPCs透性和凋亡的影響30-31
• 3.9 NO供體對(duì)ADMA誘導(dǎo)RPCs透性和凋亡的改變的影響31
• 3.10 Cx43、p-Cx43的表達(dá)變化31-32
• 3.10.1 視網(wǎng)膜組織中Cx43和p-Cx43的表達(dá)31
• 3.10.2 高糖對(duì)Cx43和p-Cx43表達(dá)的影響31
• 3.10.3 外源性ADMA對(duì)Cx43和p-Cx43表達(dá)的影響31
• 3.10.4 NO供體對(duì)ADMA誘導(dǎo)的Cx43 mRNA表達(dá)變化的影響31-32
• 3.11 高糖和外源性ADMA對(duì)細(xì)胞間通訊功能GJIC的影響32
• 3.12 EphA2的表達(dá)變化32
• 3.12.1 視網(wǎng)膜組織中EphA2的表達(dá)32
• 3.12.2 高糖對(duì)EphA2表達(dá)的影響32
• 3.12.3 外源性ADMA對(duì)EphA2表達(dá)的影響32
• 3.12.4 NO供體對(duì)ADMA誘導(dǎo)的EphA2表達(dá)變化的影響32
• 3.13 DDAH1、DDAH2及DDAH1+2 siRNA的原代大鼠RPCs的建立32-33
• 3.14 DDAH siRNA對(duì)RPCs上清液中ADMA和NO水平的影響33
• 3.15 DDAH siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的RPCs透性和凋亡增加的影響33
• 3.16 DDAH siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的Cx43和p-Cx43表達(dá)下調(diào)的影響33
• 3.17 DDAH siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的EphA2表達(dá)上調(diào)的影響33-34
• 附圖34-50
• 4 討論50-53
• 5 小結(jié)53-54
• 6 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 綜述60-69
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果69-70
• 致謝70

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本文編號(hào)：364995