發(fā)布時(shí)間：2017-04-06 00:03

  本文關(guān)鍵詞：色素上皮衍生因子抑制堿燒傷角膜新生血管的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多種眼表疾病如感染性角膜疾病、眼化學(xué)傷、熱燒傷、非感染性角膜疾病角膜變性的顯著特征之一,也是角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素.CNV是臨床上最常見、治療最棘手的致盲性眼科疾病之一。其預(yù)后與角膜損傷的范圍、時(shí)間、治療方法密切相關(guān),抑制新生血管的形成對(duì)保持角角膜透明性和免疫赦免狀態(tài)意義重大,因而尋找安全、有效的治療措施已成為眼科工作者的主要任務(wù)。 CNV的發(fā)生機(jī)制尚不清楚,但是角膜血管生成受血管增生刺激因子和血管增生抑制因子的調(diào)節(jié)。一般認(rèn)為,要維持角膜的無血管狀態(tài),角膜必須低表達(dá)血管生成因子,同時(shí)高表達(dá)血管生成抑制因子。這一動(dòng)態(tài)平衡若被打破,便會(huì)引起角膜新生血管化。 常見的血管增生刺激因子有血管內(nèi)皮生長因(vascularendothelialgrowth factor-VEGF)成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血管生成素、胰島素樣生長因子等,其中VEGF能使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、移行,毛細(xì)血管基底膜降解,形成新的血管腔,被認(rèn)為是目前最有效的血管生成促進(jìn)因子。 常見的血管增生抑制因子有色素上皮衍生因子(pigment epithelium—derived factor,PEDF)、纖維蛋白溶酶原、血管抑素、內(nèi)皮抑素等。其中PEDF能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞移行和角膜血管化,被認(rèn)為是目前最有效的血管生成抑制因子。 目前臨床上治療CNV的新進(jìn)展分為藥物、基因和手術(shù)治療,藥物治療包括VEGF相關(guān)藥物、環(huán)氧化酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥等。基因治療包括重組人表皮生長因子、核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑等。手術(shù)治療包括局部處理過的牛心包遮蓋治療堿燒傷后角膜穿孔、羊膜移植、人工角膜和組織工程角膜等。 因?yàn)閂EGF是新生血管生成的主要促進(jìn)因子,具有促進(jìn)血管通透性增加,細(xì)胞外基質(zhì)變性,血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用。因此,阻斷或抑制(?)VEGF表達(dá)的藥物是一種有效的抗新生血管藥物。根據(jù)阻斷VEGF的不同途徑主要分為抗VEGF抗體、抗VEGF適體、抗VEGF受體、VEGFR酪氨酸激酶抑制劑和蛋白激酶C抑制劑。所以目前研究中的VEGF(?)目關(guān)藥物有抗VEGF抗體、抗VEGF適體、酶抑制劑及其他抑制因子。其中其他VEGF抑制因子有PEDF、生長抑素、血管抑素、內(nèi)皮抑素等。 色素上皮細(xì)胞衍生因子(pigment epithelium—derived factor, PEDF)是人及動(dòng)物眼中天然存在的一種糖蛋白,由視網(wǎng)膜色素上皮分泌,分子量為50KD,具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,N端的神經(jīng)營養(yǎng)區(qū)域和C端的絲氨酸蛋白酶抑制超基因家族反應(yīng)環(huán)。 早期對(duì)人胚和牛眼的研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞可表達(dá)PEDF蛋白,并分泌到周圍視網(wǎng)膜感光細(xì)胞間質(zhì)(IPM)中,后來發(fā)現(xiàn)角膜組織和睫狀上皮中也有PEDF的表達(dá),尤其在角膜緣上皮中有強(qiáng)烈表達(dá)。對(duì)人睫狀上皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)在睫狀上皮非色素細(xì)胞中可見很強(qiáng)的PEDF的免疫反應(yīng)。這說明睫狀上皮非色素細(xì)胞可分泌PEDF。另外眼的房水和玻璃體中也含有PEDF,房水的PEDF在生理情況下主要由睫狀上皮細(xì)胞合成和分泌,而玻璃體內(nèi)的PEDF主要由視網(wǎng)膜分泌,且含量很高。有研究表明視網(wǎng)膜感光細(xì)胞間基質(zhì)(IPM)中PEDF濃度最高,約是玻璃體中濃度的10倍是房水中濃度的100倍。 PEDF具有抗血管新生和神經(jīng)保護(hù)的雙重作用。以往對(duì)PEDF的神經(jīng)保護(hù)作用及抗腫瘤作用研究較多,1999年Dawson DW等首次發(fā)現(xiàn)PEDF還具有很強(qiáng)的抑制血管的作用,可能是維持角膜、玻璃體等眼內(nèi)組織無血管形成的主要原因,在玻璃體內(nèi)是主要的血管增生抑制劑。 研究結(jié)果顯示PEDF對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞如牛腎上腺、人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞和臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞等有特異性的抑制作用,PEDF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性,其半數(shù)有效劑量(median effective dose, ED50)為0.4mo1/L是目前用抑制內(nèi)皮細(xì)胞移行方法測(cè)得的活性最高的抑制因子。Stellmach V等發(fā)現(xiàn)PEDF在抑制異常新生血管形成的同時(shí),對(duì)已構(gòu)建的視網(wǎng)膜血管不產(chǎn)生明顯的損害；即使給予高劑量的PEDF,血管內(nèi)皮細(xì)胞正常的形成和發(fā)育也不受影響。這顯示PEDF只對(duì)正在進(jìn)行病理性新生血管形成的血管組織產(chǎn)生損害。Duh E J等在小鼠缺血性視網(wǎng)膜病變模型研究中發(fā)現(xiàn),玻璃體內(nèi)注射2種重組的人PEDF,均可明顯抑制視網(wǎng)膜新生血管從而證實(shí)了PEDF能夠有效抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成。 鑒于PEDF在抑制視網(wǎng)膜新生血管方面的研究進(jìn)展,目前國內(nèi)外學(xué)者開始將PEDF應(yīng)用于抑制角膜新生血管,已在大鼠和兔模型上取得一定成果。但PEDF抑制新生血管的機(jī)制目前尚未明確,目前研究認(rèn)為PEDF可能是是通過以下途徑發(fā)揮作用：1)抑制血管生成誘導(dǎo)劑,有研究表明PEDF可以直接通過自身受體和信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制UVEGF、血小板衍生因子、血管內(nèi)皮生長因子、白介素酸性成纖維細(xì)胞生長因子等多種血管生成誘導(dǎo)劑的表達(dá)。2)抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Stellmach等認(rèn)為PEDF可能是通過促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,使血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧誘發(fā)的新生血管的信號(hào)不起反應(yīng)。目前研究認(rèn)為:PEDF是通過細(xì)胞凋亡受體配體(Fas/FasL)系統(tǒng)辨別新形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞和已經(jīng)存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞從而選擇性誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此,我們的實(shí)驗(yàn)通過局部應(yīng)用外源性PEDF,觀察其對(duì)堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管的影響；HE染色觀察其對(duì)大鼠角膜病理改變的影響；免疫組化法檢測(cè)角膜組織中VEGF、PEDF、Fas/FasL蛋白表達(dá)的變化及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法-TUNEL法測(cè)定),旨在探討其在抑制角膜血管新生過程中的可能作用機(jī)制。 第一部分PEDF對(duì)堿燒傷大鼠角膜新生血管作用的觀察和對(duì)新生血管化角膜中VEGF、PEDF表達(dá)的影響 目的 研究PEDF抑制堿燒傷大鼠角膜新生血管的生長情況,檢測(cè)大鼠新生血管化角膜中VEGF、PEDF的表達(dá)量,初步探討其抑制角膜新生血管的可能機(jī)制。 方法 健康成年雌性SD大鼠36只,堿燒傷法制作角膜新生血管模型,均以雙眼制作堿燒傷模型。將CNV化大鼠隨機(jī)分組(A、B)兩組,A組：PEDF治療組(12只)、B組：生理鹽水對(duì)照組(12只)。并以正常大鼠做對(duì)照,C組：正常角膜組(12只)。分別于建模后第4天、7天、10天、14天裂隙燈顯微鏡下觀察各組角膜新生血管的生長情況并計(jì)算角膜新生血管生長面積；并在建模后第4天、7天、10天、14天每組處死兩只大鼠,HE染色后在光鏡下觀察新生血管化角膜病理組織形態(tài),并采用免疫組化方法檢測(cè)VEGF、PEDF蛋白的表達(dá)量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用x±s表示。組間比較采用單因素方差分析,多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較SNK-q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 建模后第4天、7天、10天、14天,生理鹽水對(duì)照組CNV(x±s)的面積分別為(5.31±0.46)mm2、(16.90±0.06)mm2、(23.45±0.09)mm2、(28.26±0.02)mm2；而PEDF治療組CNV(x±s)的面積分別為(2.60±0.15)mm2、(10.07±0.25)mm2、(20.92±0.05)mm2、(25.97±0.04)mm2；正常組未見新生血管。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組CNV面積比較,PEDF治療組均小于生理鹽水對(duì)照組,P0.05。兩組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間CNV面積存在顯著性差異,P0.05。 各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜HE染色觀察結(jié)果：兩組均在建模后第4天開始在角膜基質(zhì)層觀察到少量新生血管和炎性細(xì)胞浸潤,第7-10天角膜基質(zhì)層可見大量新生血管和炎性細(xì)胞,第14天可見角膜基質(zhì)新生血管密度較前減少,可見較多成熟新生血管,內(nèi)有紅細(xì)胞。但兩組CNV比較：生理鹽水治療組基質(zhì)層可見大量新生血管,管腔大,有淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的浸潤,炎癥反應(yīng)較重；相比之下,PEDF組新生血管明顯減少,炎癥反應(yīng)較輕。兩組均在第10天觀察到最多的角膜新生血管和炎癥細(xì)胞侵潤,P0.05。 各時(shí)間點(diǎn)三組VEGF、PEDF的免疫組化結(jié)果： PEDF在正常角膜上皮和內(nèi)皮層均有微量表達(dá),而VEGF在正常角膜微量表達(dá)或者不表達(dá),兩者在正常角膜表達(dá)陽性程度比較,PEDFVEGF,P0.05。 堿燒傷后兩種因子表達(dá)均上升,因此在各時(shí)間點(diǎn)兩者在PEDF組和生理鹽水組表達(dá)均高于正常角膜,P0.05。建模后第7天,兩組內(nèi)VEGF的表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn),P0.05；建模后第10天,兩組內(nèi)PEGF的表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn),P0.05。建模后第4、7天,兩組內(nèi)PEDF的表達(dá)量均低于VEGF, P0.05；建模后第10,14天,兩組內(nèi)PEDF的表達(dá)量均高于VEGF。 各時(shí)間點(diǎn)PEDF在PEDF治療組的表達(dá)量均高于生理鹽水組,P0.05；而各時(shí)間點(diǎn)VEGF在在PEDF治療組的表達(dá)量均低于生理鹽水組,P0.05。 堿燒傷后第4天和第7天,VEGF/PEDF1,堿燒傷后第7天和14天,VEGF/PEDF1。 結(jié)論 檢測(cè)到內(nèi)生性PEDF在角膜組織的確切表達(dá)。外源性PEDF的局部應(yīng)用補(bǔ)充了內(nèi)源性PEDF,增強(qiáng)和證實(shí)了PEDF抑制角膜新生血管的作用。發(fā)現(xiàn)堿燒傷促進(jìn)了PEDF和VEGF的表達(dá),兩者都是先上升后下降趨勢(shì),VEGF在堿燒傷后第7天表達(dá)達(dá)到峰值,隨后下降；而PEDF在第10天表達(dá)達(dá)到峰值,隨后下降。且可以觀察到,在新生血管初生到發(fā)展到極期(第0-7天),PEDF表達(dá)一直低于VEGF表達(dá),即VEGF/PEDF1,CNV生長；然而在新生血管成熟和消退期(第10～14天),PEDF表達(dá)開始并一直高于VEGF,即VEGF/PEDF1,CNV消退。第7～10是VEGF/PEDF比值發(fā)生逆轉(zhuǎn)性變化的時(shí)期,也是肉眼觀察到的角膜新生血管生長最盛的時(shí)期。VEGF/PEDF比值的變化恰好可以反映在大體角膜CNV的變化觀察中。 因此,本實(shí)驗(yàn)可以證明,PEDF在正常角膜中確實(shí)存在,且具有抑制CNV的作用。外源性局部應(yīng)用PEDF可以明顯增強(qiáng)抑制CNV發(fā)生的作用。而VEGF/PEDF的比值變化結(jié)果可以初步推論P(yáng)EDF可能是通過抑制VEGF的產(chǎn)生來發(fā)揮抑制CNV的作用的。因此PEDF抑制CNV的機(jī)制之一可能是通過某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制VEGF的表達(dá)。 第二部分PEDF對(duì)堿燒傷大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表達(dá)及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 目的 檢測(cè)局部應(yīng)用PEDF滴眼對(duì)堿燒傷大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表達(dá)的影響及對(duì)新生血管化角膜中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法———TUNEL法測(cè)定)的影響。 方法 健康成年雌性SD大鼠36只,堿燒傷法制作角膜新生血管模型,均以雙眼制作堿燒傷模型。將CNV化大鼠隨機(jī)分組(A、B)兩組,A組：PEDF治療組(12只)、B組：生理鹽水對(duì)照組(12只)。并以正常大鼠做對(duì)照,C組：正常角膜組(12只)。分別于建模后第4天、7天、10天、14天每組處死三只大鼠,取下6只帶角鞏緣的完整角膜,分別行免疫組化方法檢測(cè)Fas、FasL蛋白的表達(dá)量和TUNEL法檢測(cè)角膜組織中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用x±s表示。組間比較采用單因素方差分析,多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較SNK-q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)。P0.05,為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 Fas、FasL在正常角膜均有微量表達(dá),表達(dá)于角膜上皮層和內(nèi)皮層。堿燒傷后,兩種因子在兩組新生血管化角膜中表達(dá)先上升后下降,但均高于正常角膜,P0.05；第10天表達(dá)最高,明顯高于其他時(shí)間點(diǎn),P0.05。各時(shí)間點(diǎn),PEDF治療組Fas、FasL表達(dá)均高于生理鹽水組,P0.05。 TUNEL法染色三組角膜,正常角膜上皮未檢測(cè)到凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞,另兩組新生血管化角膜各時(shí)間點(diǎn)均可檢測(cè)到凋亡的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞,PEDF治療組明顯高于生理鹽水組,P0.05。兩組均在第10天檢測(cè)到的凋亡新生血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)最多,明顯高于其他時(shí)間點(diǎn),P0.05。 結(jié)論 TUNEL法是目前檢測(cè)凋亡的新方法,其檢測(cè)到的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)和Fas/FasL表達(dá)的趨勢(shì)一致,說明了新生血管化角膜中Fas/FasL的表達(dá)可能促進(jìn)了新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)了CNV的退化。 Fas、FasL是凋亡受體配體,其表達(dá)量的升高可能誘導(dǎo)了新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)了CNV的退化,其在第10天達(dá)到峰值,與上文PEDF的峰值一致,說明了PEDF抑制CNV的機(jī)制之二可能是通過誘導(dǎo)凋亡受體、配體(Fas/FasL)的表達(dá)來間接誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮的凋亡,從而發(fā)揮抗CNV的作用。
【關(guān)鍵詞】：色素上皮衍生因子 血管內(nèi)皮生長因子 細(xì)胞凋亡受體/配體 角膜新生血管凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-29
• 參考文獻(xiàn)26-29
• 第一部分 PEDF對(duì)堿燒傷大鼠角膜新生血管作用的觀察和對(duì)新生血管化角膜中VEGF、PEDF表達(dá)的影響29-47
• 1 材料29-31
• 2 方法31-34
• 3 結(jié)果34-38
• 4 討論38-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 第二部分 PEDF對(duì)堿燒傷大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表達(dá)的影響及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響47-66
• 引言47
• 1 材料47-50
• 2 方法50-54
• 3 結(jié)果54-56
• 4 討論56-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 全文總結(jié)與展望66-69
• 附錄一 綜述69-79
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 附錄二 縮略詞表79-80
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文和成果80-81
• 致謝81-82

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 趙慧英,孫旭光;血管生成素與眼部新生血管的關(guān)系[J];國際眼科雜志;2004年05期

2 穆華;張曉梅;;色素上皮衍生因子與眼部新生血管[J];國際眼科雜志;2006年04期

3 王紹飛;任兵;高曉唯;;PEDF的研究進(jìn)展[J];國際眼科雜志;2007年04期

4 陳琳;Fas/FasL與眼新生血管[J];國外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊(cè);2001年06期

5 劉學(xué)政,李錦平,蕭鴻,曲維新,李瑞祥;糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡——TUNEL法研究[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年04期

6 劉學(xué)政;細(xì)胞凋亡(Apoptosis)的研究概況[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年06期

7 向江東;周莉娜;席曉薇;;PEDF在腫瘤中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2011年04期

8 潘雪菲;樊映川;;眼部新生血管藥物治療研究進(jìn)展[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2010年02期

  本文關(guān)鍵詞：色素上皮衍生因子抑制堿燒傷角膜新生血管的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：287889