OSA_(Obstructive sleep apnea)是一種影響人類全身多系統(tǒng)的睡眠呼吸障礙性疾病,主要表現(xiàn)為睡眠打鼾及睡眠結(jié)構(gòu)的紊亂、反復低氧血癥。其解剖結(jié)構(gòu)基礎為上氣道的阻塞和塌陷,病理生理基礎是慢性間歇性缺氧/復氧(intermittent hypoxia/reoxygenation,IHR),導致夜間睡眠血氧不足,通過缺血-再灌注損傷引起氧自由基的產(chǎn)生,出現(xiàn)局部和全身性的炎癥反應,從而引起肝、肺、心腦血管等損害。多年來的研究證實,OSA患者缺氧的嚴重程度與肝臟異常的脂質(zhì)代謝、脂肪肝的形成及血脂升高密切相關。大量動物模型研究也表明,慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)可引起大鼠多個器官的損害。但其內(nèi)在發(fā)病機制還不是很明確,其發(fā)生機制具有爭議性,對其藥物的治療也不是很多見。本文旨在從分子、細胞層面探討CIH對大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響及可能的損害機制,并加以藥物干預,分析其作用機制,為臨床治療和預防OSA疾病提供理論依據(jù)。N-acetylcysteine(NAC,N-乙酰半胱氨酸)作為一種可以用于人體和動物的抗氧化劑,它不僅具有明顯的抑制活性氧自由基的作用,同時也可以消除機體已存在的活性氧自由基,對于防止組織細胞損傷、改善細胞代謝活性、促進組織細胞功能的恢復具有較好的作用,從分子水平上有調(diào)控信號通路和基因表達的機制。對NAC的研究,目前主要集中在呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面,在肝臟等消化系統(tǒng)方面的作用,報道尚少。由于OSA對人體的影響是多系統(tǒng)的,CIH對動物的影響也是全面的,因而我們推測,CIH誘導下大鼠肝臟有可能會出現(xiàn)代謝異常和損害。由于NAC具有積極而廣泛的治療作用,我們同樣推測它在肝臟方面也可能具有積極的保護和治療作用。本實驗就是主要探討CIH下大鼠肝臟的損害機制和NAC的治療作用。由于倫理道德因素的限制,是不可能以人本身作為實驗對象的,而單純靠臨床知識和經(jīng)驗的積累,又有很大的局限性。因而,對實驗動物的研究就顯得非常重要。而要進行動物實驗研究,建立合適有效的模型首當其沖。自1992年Fletcher第一次報道低氧-復氧大鼠模型以來,20多年間出現(xiàn)了多種多樣的實驗模型,各有各的特點,但仍處于不斷探索和改進階段。我們經(jīng)過多年的實驗積累和改進,在電子裝備工程師的支持下,建立了一整套適合多種動物和細胞研究的CIH模型,幫助我們成功完成了包括本實驗在內(nèi)的多個實驗研究。第一部分 慢性間歇性低氧動物模型的建立及意義目的選取大鼠為實驗動物,建立慢性間歇性低氧動物模型,為OSA的基礎研究提供一個可靠的實驗平臺。方法低氧艙系統(tǒng)的制備:采用彩色觸摸屏、可編程邏輯控制器(Programmable Logic Controller,PLC)自動控制和自動數(shù)據(jù)采集監(jiān)測系統(tǒng),制造建立實驗模型所需要的裝備。低氧艙控制裝置的主體設備主要由以下三個組成部分:主機部分、低氧艙體和氣路控制部分。模型的建立:30只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成2組,每組15只,分別為常氧對照組(CON組)和慢性間歇性低氧模型組(CIH組)。CON組置于常氧對照艙。適應性飼養(yǎng)1周。置于同一實驗環(huán)境,室溫23℃,濕度50%,普通喂養(yǎng)。低氧艙設置為5%低氧濃度,低氧時間40秒(包括緩沖時間5秒),常氧時間40秒(包括緩沖時間5秒),以“低氧-常氧-低氧”模式循環(huán)進行,8小時/天,09:00-17:00,連續(xù)飼養(yǎng)9周。取材和標本的制備:普通喂養(yǎng),9周后解剖所有大鼠,嚴格按照實驗要求獲取肝臟標本。進行油紅“O”染色、HE染色、透射電鏡觀察。HE染色光鏡下觀察各組肝臟組織的形態(tài)學變化。透射電鏡觀察各組肝組織細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。油紅“O”染色通過Image-pro Plus(IPP)細胞圖像分析管理系統(tǒng)進行定量分析。結(jié)果1.形態(tài)學改變:CIH組的HE染色可見脂質(zhì)積聚、脂肪空泡形成,導致肝細胞脂肪變性。電鏡下超微結(jié)構(gòu)見大量簇狀脂滴、自噬小體和溶酶體大量出現(xiàn)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖原的灶性聚積、毛細膽管微絨毛變得稀疏。CON組則很少見此征象,此模型下CIH組大鼠肝細胞形態(tài)學發(fā)生了明顯改變。2.脂質(zhì)油紅“O”染色結(jié)果:紅色顆粒為脂質(zhì)樣物。CON組與CIH組IOD/Area(有效統(tǒng)計區(qū)域面積內(nèi)的累計光密度平均值)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。CIH組肝細胞脂質(zhì)明顯染紅,CON組肝細胞染紅很輕微,說明模型造成了兩組樣本之間的差異。3.CIH動物模型建立的結(jié)果:通過CON組與CIH組大鼠肝臟細胞形態(tài)學方面的觀察和研究,有明顯的細胞受損方面的表現(xiàn),支持CIH下肝組織出現(xiàn)功能障礙的體征。我們建立的此套CIH模型,運行良好。結(jié)論1.慢性間歇性低氧動物模型建立成功。2.此模型下的大鼠符合OSA的病理生理特點。3.此模型作為進一步研究OSA的實驗平臺是可靠有效的。第二部分 慢性間歇性低氧大鼠肝臟脂質(zhì)代謝異常的發(fā)生機制和N-acetylcysteine 的治療作用目的探討CIH誘導的大鼠肝組織損害和肝臟脂質(zhì)代謝障礙的可能的發(fā)病機制,N-acetylcysteine(NAC)對CIH大鼠模型下的異常肝臟脂質(zhì)代謝可能的治療作用。方法建立模型:60只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成4組,每組15只,分別為常氧對照組(CON組),慢性間歇性低氧模型組(CIH組),模型對照組(CIH+NS組),治療組(CIH+NAC組)。適應性飼養(yǎng)1周。置于同一實驗環(huán)境,室溫23℃,濕度50%,普通喂養(yǎng)。低氧艙設置為5%低氧濃度,低氧時間40秒(包括緩沖時間5秒),常氧時間40秒(包括緩沖時間5秒),以“低氧-常氧-低氧”模式循環(huán)進行,8小時/天,09:00-17:00,連續(xù)飼養(yǎng)9周。治療組于每日低氧前15分鐘腹腔注射NAC+NS(20mg/Kg.d,1%),模型對照組注射同等體積的NS,連續(xù)9周。組織的制備和檢測.:普通喂養(yǎng),9周后分別取大鼠肝臟組織,嚴格按檢測標本要求給予冷凍、固定等妥善處理。1.分別記錄初始和終末體重(g),進行統(tǒng)計學比較。2.采用HE染色觀察肝細胞的形態(tài)學改變。3.油紅“O”染色觀察肝臟脂質(zhì)代謝的病理變化,Image-pro Plus(IPP)細胞圖像分析管理系統(tǒng)進行定量分析。4.透射電鏡下觀察肝細胞的超微結(jié)構(gòu)及其損傷改變。5.應用DHE熒光探針評估肝細胞的氧化應激水平,即ROS(活性氧自由基簇),IPP細胞圖像分析管理系統(tǒng)進行定量。6.免疫組織化學染色觀察肝細胞內(nèi)炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNFα)的含量,IPP細胞圖像分析管理系統(tǒng)進行定量分析。7.Real-time PCR 檢測 NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNFα 相關基因 mRNA 的表達水平。8.Western blotting 檢測 NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNFα 蛋白的表達,結(jié)果以β-actin為內(nèi)參照,用ImageJ圖像分析軟件進行條帶灰度分析,測定各目的蛋白條帶的灰度值,用目的蛋白/內(nèi)參灰度值來表示目的蛋白的相對表達量。9.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清LPL含量,Peroxidase Anti-peroxidase Method(PAP酶法)檢測血清血脂水平(TG、TC),進行各組之間對比分析。結(jié)果1.與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠體重明顯增長(P0.05);與模型對照組比較,治療組體重增長正常(P0.05),肥胖趨勢明顯,治療后緩解。2.與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟HE染色,細胞的形態(tài)學出現(xiàn)脂質(zhì)積聚、脂肪空泡形成,導致肝細胞脂肪變性,脂質(zhì)代謝異常。與模型對照組比較,治療組則明顯好轉(zhuǎn),脂質(zhì)代謝改善。3.紅色顆粒為脂質(zhì)樣物。與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟脂質(zhì)油紅“O”染色,細胞脂質(zhì)明顯染紅,與模型對照組比較,治療組脂質(zhì)染紅減輕。IOD/Area差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示,細胞內(nèi)見脂滴積聚、大量自噬小體、溶酶體的出現(xiàn),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖原的灶性聚積及毛細膽管微絨毛稀疏。與模型對照組比較,治療組則很少見此征象,脂滴減少,超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。5.紅色熒光為陽性表達。與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟氧化應激ROS表達明顯;與模型對照組比較,治療組ROS表達減少。IOD/Area差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.其作為陽性的標志為黃色顆粒。與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟免疫組織化學檢測IL-1β,IL-6和TNFα,炎癥水平明顯上調(diào)(P0.05),蛋白表達顯著;與模型對照組比較,治療組炎癥水平下調(diào)(P0.05),蛋白表達弱。IOD/Area值差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.與常氧對照組比較,低氧模型組大鼠肝臟NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNFα基因mRNA的表達顯著,與模型對照組比較,治療組表達弱。基因表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8.與常氧對照組比較,低氧模型組肝臟NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNFαα蛋白相對表達顯著,與模型對照組比較,治療組表達弱。蛋白的相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。9.與常氧對照組比較,低氧模型組肝臟血清LPL下調(diào)和血脂TG、TC上調(diào)(P0.05);與模型對照組比較,治療組相反,LPL下降及血脂上升(P0.05),比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.CIH誘導的大鼠肝組織出現(xiàn)氧化應激產(chǎn)生大量ROS。2.CIH激活ROS/NF-κB信號通路并且調(diào)控炎癥因子的表達。3.CIH下調(diào)血清LPL、上調(diào)TG和TC水平。4.CIH可引起大鼠肝細胞脂質(zhì)聚集和損傷及異常體重增加。5.CIH誘導的大鼠肝組織損害可能與ROS/NF-KB信號通路有關。6.NAC可改善慢性間歇性低氧大鼠模型下的脂質(zhì)代謝障礙和體重異常增加,其機制可能與抑制ROS/NF-KB信號相關。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R766
【部分圖文】：

圖２．?Ａ為氣路控制流程模擬圖。Ｂ為氣體來源和輸入輸出實物圖。①白箭頭為空氣壓縮機，??黑箭頭為氮氣嫌。②主機和氧船的連接．其中白箭頭為空氣輸入，黑箭頭為氮氣輸入，紅??箭頭為混合氣體輸出進入動物艙體。??２４??

圖３？輸入空氣、氮氣周期時序模擬圖

圖３組大鼠肝細胞形態(tài)學改變：常氧對照組（ＣＯＮ），ＣＩＨ棋型組（ＣＩＨ），ＣＩＨ＋０．９％??ＮａＣｌ?模型對照組（ＣＩＨ＋ＮＳ），ＣＩＨ＋?Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ?治療組（ＣＩＨ＋ＮＡＣ）。（Ａ）?ＨＥ?染??色和袖紅“０’，染色，ｘ４００，ｓｃａｌｅｂａｒ：２〇ｎｍＢ?透射電鏡（ＴＥＭ）?，?ｓｃａｌｅｂａｒ：２ｎｍ?（插圖為較??低放大倍數(shù)，ｓｃａｌｅ?ｂａｒ：５ｆｉｍ）。圖片中字母符號：ＬＤ－脂滴，ＡＰ－自噬小體，ＬＰ名薄體，??ＢＣ－毛細膽管｜?ＭＩ－線粒體，ＲＥＲ－粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，ＧＬ－糖原。（Ｂ）?ＩＯＤ／Ａｒｅａ?（ｄｅｎｓｉｔｙ?ｍｅａｎ）??為有效統(tǒng)計區(qū)域面積內(nèi)的累計光密度平均值。＊戶＜０．０５，?＃Ｐ＞０．０５。??４９??
【參考文獻】

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1 慕超;王巖;李延忠;;重度阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清缺氧誘導因子-1α和胰島素樣生長因子-1及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與認知功能的關系[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2014年12期

本文編號：2872689