目的1.研究自身免疫性葡萄膜炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中miR-30b-5p的表達(dá)水平以及白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)、Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR 4)mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化,進(jìn)而探討miR-30b-5p、IL-10和TLR 4在葡萄膜炎發(fā)病中的作用機(jī)制。2.研究在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠模型中rno-miR-30b-5p在眼球、脾臟和淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平改變及IL-10和TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)水平改變與葡萄膜炎之間的關(guān)系;探討EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)T細(xì)胞中加入rno-miR-30b-5p模擬劑和抑制劑干預(yù)后IL-10,TLR4表達(dá)失衡與EAU發(fā)生之間的關(guān)系。方法1.收集處于活動(dòng)期的前葡萄膜炎患者及健康人群外周血4ml,分離收集外周血T淋巴細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-30b-5p、IL-10和TLR4的基因表達(dá)變化;ELISA檢測(cè)血清中IL-10、TLR4的蛋白濃度變化;2.對(duì)IL-10、TLR4基因序列及載體序列進(jìn)行分析后,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得IL-10、TLR4基因的3’UTR序列;在野生型(WT)載體基礎(chǔ)上,以IL-10、TLR4基因的3′UTR序列為模板,在引物上引入突變堿基,獲得定點(diǎn)突變序列。將野生型和突變型(Mut)目的基因片段分別克隆到pmiR-RB-REPORT?雙熒光素酶報(bào)告載體中,成功構(gòu)建質(zhì)粒載體和突變質(zhì)粒載體;同時(shí),將rno-miR-30b-5p mimic與構(gòu)建好的報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)報(bào)告基因相對(duì)熒光值的表達(dá)改變分析rno-miR-30b-5p與靶基因之間是否存在調(diào)控作用關(guān)系;3.隨機(jī)挑選6~8周齡雌性Lewis大鼠分為正常對(duì)照組和EAU組,每組各6只,其中EAU組大鼠注射光感受器間維生素A類(lèi)結(jié)合蛋白(IRBP_(1177-1191))、完全弗氏佐劑(CFA)、結(jié)合菌素(TB)和PBS300μl乳糜液以誘導(dǎo)EAU模型,正常對(duì)照組大鼠相同部位注射等量不含IRBP的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相機(jī)觀察EAU大鼠眼部炎癥變化,并進(jìn)行臨床評(píng)分。當(dāng)EAU大鼠在第12天達(dá)到炎癥達(dá)高峰期時(shí),過(guò)量麻醉處死大鼠,摘取大鼠眼球分別進(jìn)行HE病理染色,比較大鼠眼組織病理學(xué)差異;PCR檢測(cè)rno-miR-30b-5p的表達(dá)。同時(shí)分離淋巴結(jié)和脾臟組織,通過(guò)PCR檢測(cè)rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4基因的表達(dá)變化,ELISA檢測(cè)IL-10和TLR4蛋白的表達(dá)變化。4.用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離收集EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞,分別用促進(jìn)和抑制rno-miR-30b-5p表達(dá)的rno-miR-30b-5p模擬劑(mimic)和拮抗劑(inhibitor)進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)染,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組T細(xì)胞的IL-10、TLR4表達(dá)變化,PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組T細(xì)胞中IL-10、TLR4基因的表達(dá)變化,ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組T細(xì)胞中IL-10和TLR4蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果1.PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):前葡萄膜炎患者活動(dòng)期外周血T淋巴細(xì)胞中miR-30b-5p的表達(dá)水平升高,而IL-10和TLR4 mRNA出現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá)(均為P0.05);ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),血清中IL-10、TLR4蛋白水平也顯著下調(diào)表達(dá)(均為P0.05);2.根據(jù)靶基因鑒定進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)rno-miR-30b-5p mimic對(duì)IL-10、TLR4野生型的報(bào)告熒光有明顯的下調(diào)作用,對(duì)其預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后,突變型載體中的報(bào)告熒光也存在明顯的下調(diào)作用;3.EAU大鼠免疫后第12天炎癥達(dá)到高峰,組織病理學(xué)檢查結(jié)果與眼底照相機(jī)觀察眼前段炎性表現(xiàn)結(jié)果一致。PCR檢測(cè)結(jié)果表明,rno-miR-30b-5p在EAU大鼠眼球、脾臟和淋巴結(jié)組織中呈明顯的下調(diào)表達(dá),而IL-10、TLR4 mRNA和蛋白呈顯著的上調(diào)表達(dá),與正常對(duì)照組相比,表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P0.05)。4.體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與EAU對(duì)照組、模擬劑陰性對(duì)照(mimic Negative,mimic N)組相比,加入rno-miR-30b-5p mimic干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組的IL-10、TLR4的基因和蛋白出現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá);經(jīng)rno-miR-30b-5p inhibitor干預(yù)后,淋巴結(jié)組中IL-10、TLR4 mRNA顯著上調(diào)表達(dá)(均為P0.05);脾臟組中,TLR4 mRNA為顯著上調(diào)表達(dá)(P0.05),而IL-10mRNA的上調(diào)表達(dá)不明顯(P0.05);rno-miR-30b-5p inhibitor脾臟和淋巴結(jié)組中,IL-10、TLR4蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)與EAU空白組、抑制劑陰性對(duì)照組(inhibitor Negative,inhibitor N)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與EAU對(duì)照組和mimic N比較,rno-miR-30b-5p mimic干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組中IL-10,TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯降低(均為P0.05);而與EAU對(duì)照組和inhibitor N相比,rno-miR-30b-5p inhibitor干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組的IL-10,TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(均為P0.05)。結(jié)論1.前葡萄膜炎患者活動(dòng)期外周血T淋巴細(xì)胞中高表達(dá)的miR-30b-5p,通過(guò)抑制IL-10和TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá),調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展;2.靶點(diǎn)鑒定實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)IL-10、TLR4是rno-miR-30b-5p調(diào)控的靶基因,rno-miR-30b-5p能夠負(fù)調(diào)控IL-10、TLR4的表達(dá),該研究為進(jìn)一步探索microRNA在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ);3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)中,rno-miR-30b-5p能夠顯著下調(diào)IL-10和TLR4的基因的表達(dá)。因此,rno-miR-30b-5p可通過(guò)調(diào)控IL-10、TLR4表達(dá)水平,調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)展進(jìn)程。本研究為進(jìn)一步探索microRNA在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的調(diào)控作用以及治療葡萄膜炎奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R773.9
【部分圖文】：

miR-30b-5p在活動(dòng)期前葡萄膜炎患者和健康對(duì)照組外周血中的表達(dá)水平注：*P<0.05，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

IL-10，TLR4mRNA的表達(dá)水平變化

IL-10蛋白的表達(dá)水平變化；B：TLR4蛋白的表達(dá)水平變化
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 許橙;韓東旭;袁寶;張國(guó)梁;吳健;陳健;戴立勝;姜昊;高妍;張嘉保;;miR-141-3P和miR-346在對(duì)靶基因FSHR的識(shí)別與驗(yàn)證[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年11期

2 呂洋;燕振國(guó);;microRNA在眼內(nèi)的表達(dá)及其與常見(jiàn)眼部疾病的關(guān)系[J];西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;2014年03期

3 余奇;許迅;;實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎模型的研究進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年10期

4 楊培增;;葡萄膜炎的研究進(jìn)展[J];中華眼科雜志;2005年12期

本文編號(hào)：2868042