rno-mir-30b-5p對葡萄膜炎大鼠白介素-10、Toll樣受體4表達的調(diào)控作用及臨床研究

發(fā)布時間：2020-11-03 03:43

　　目的1.研究自身免疫性葡萄膜炎患者外周血T淋巴細胞中miR-30b-5p的表達水平以及白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)、Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR 4)mRNA和蛋白的表達水平變化,進而探討miR-30b-5p、IL-10和TLR 4在葡萄膜炎發(fā)病中的作用機制。2.研究在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠模型中rno-miR-30b-5p在眼球、脾臟和淋巴結(jié)組織中的表達水平改變及IL-10和TLR4mRNA和蛋白的表達水平改變與葡萄膜炎之間的關(guān)系;探討EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)T細胞中加入rno-miR-30b-5p模擬劑和抑制劑干預(yù)后IL-10,TLR4表達失衡與EAU發(fā)生之間的關(guān)系。方法1.收集處于活動期的前葡萄膜炎患者及健康人群外周血4ml,分離收集外周血T淋巴細胞,采用實時熒光定量PCR檢測miR-30b-5p、IL-10和TLR4的基因表達變化;ELISA檢測血清中IL-10、TLR4的蛋白濃度變化;2.對IL-10、TLR4基因序列及載體序列進行分析后,通過PCR擴增獲得IL-10、TLR4基因的3’UTR序列;在野生型(WT)載體基礎(chǔ)上,以IL-10、TLR4基因的3′UTR序列為模板,在引物上引入突變堿基,獲得定點突變序列。將野生型和突變型(Mut)目的基因片段分別克隆到pmiR-RB-REPORT?雙熒光素酶報告載體中,成功構(gòu)建質(zhì)粒載體和突變質(zhì)粒載體;同時,將rno-miR-30b-5p mimic與構(gòu)建好的報告基因載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,通過報告基因相對熒光值的表達改變分析rno-miR-30b-5p與靶基因之間是否存在調(diào)控作用關(guān)系;3.隨機挑選6~8周齡雌性Lewis大鼠分為正常對照組和EAU組,每組各6只,其中EAU組大鼠注射光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP_(1177-1191))、完全弗氏佐劑(CFA)、結(jié)合菌素(TB)和PBS300μl乳糜液以誘導(dǎo)EAU模型,正常對照組大鼠相同部位注射等量不含IRBP的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相機觀察EAU大鼠眼部炎癥變化,并進行臨床評分。當EAU大鼠在第12天達到炎癥達高峰期時,過量麻醉處死大鼠,摘取大鼠眼球分別進行HE病理染色,比較大鼠眼組織病理學(xué)差異;PCR檢測rno-miR-30b-5p的表達。同時分離淋巴結(jié)和脾臟組織,通過PCR檢測rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4基因的表達變化,ELISA檢測IL-10和TLR4蛋白的表達變化。4.用大鼠淋巴細胞分離液分離收集EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)的T淋巴細胞,分別用促進和抑制rno-miR-30b-5p表達的rno-miR-30b-5p模擬劑(mimic)和拮抗劑(inhibitor)進行T細胞轉(zhuǎn)染,通過流式細胞儀檢測各組T細胞的IL-10、TLR4表達變化,PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組T細胞中IL-10、TLR4基因的表達變化,ELISA檢測轉(zhuǎn)染后各組T細胞中IL-10和TLR4蛋白的表達變化。結(jié)果1.PCR檢測發(fā)現(xiàn):前葡萄膜炎患者活動期外周血T淋巴細胞中miR-30b-5p的表達水平升高,而IL-10和TLR4 mRNA出現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(均為P0.05);ELISA檢測發(fā)現(xiàn),血清中IL-10、TLR4蛋白水平也顯著下調(diào)表達(均為P0.05);2.根據(jù)靶基因鑒定進行分析,發(fā)現(xiàn)rno-miR-30b-5p mimic對IL-10、TLR4野生型的報告熒光有明顯的下調(diào)作用,對其預(yù)測靶位點進行突變后,突變型載體中的報告熒光也存在明顯的下調(diào)作用;3.EAU大鼠免疫后第12天炎癥達到高峰,組織病理學(xué)檢查結(jié)果與眼底照相機觀察眼前段炎性表現(xiàn)結(jié)果一致。PCR檢測結(jié)果表明,rno-miR-30b-5p在EAU大鼠眼球、脾臟和淋巴結(jié)組織中呈明顯的下調(diào)表達,而IL-10、TLR4 mRNA和蛋白呈顯著的上調(diào)表達,與正常對照組相比,表達水平差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P0.05)。4.體外細胞轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn),與EAU對照組、模擬劑陰性對照(mimic Negative,mimic N)組相比,加入rno-miR-30b-5p mimic干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組的IL-10、TLR4的基因和蛋白出現(xiàn)明顯的下調(diào)表達;經(jīng)rno-miR-30b-5p inhibitor干預(yù)后,淋巴結(jié)組中IL-10、TLR4 mRNA顯著上調(diào)表達(均為P0.05);脾臟組中,TLR4 mRNA為顯著上調(diào)表達(P0.05),而IL-10mRNA的上調(diào)表達不明顯(P0.05);rno-miR-30b-5p inhibitor脾臟和淋巴結(jié)組中,IL-10、TLR4蛋白質(zhì)的上調(diào)表達與EAU空白組、抑制劑陰性對照組(inhibitor Negative,inhibitor N)相比無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P0.05)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),與EAU對照組和mimic N比較,rno-miR-30b-5p mimic干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組中IL-10,TLR4的陽性細胞數(shù)量明顯降低(均為P0.05);而與EAU對照組和inhibitor N相比,rno-miR-30b-5p inhibitor干預(yù)的脾臟和淋巴結(jié)組的IL-10,TLR4的陽性細胞數(shù)量顯著增加(均為P0.05)。結(jié)論1.前葡萄膜炎患者活動期外周血T淋巴細胞中高表達的miR-30b-5p,通過抑制IL-10和TLR4 mRNA和蛋白的表達,調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展;2.靶點鑒定實驗進一步證實IL-10、TLR4是rno-miR-30b-5p調(diào)控的靶基因,rno-miR-30b-5p能夠負調(diào)控IL-10、TLR4的表達,該研究為進一步探索microRNA在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展進程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ);3.動物實驗和體外細胞轉(zhuǎn)染實驗研究發(fā)現(xiàn),在EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)中,rno-miR-30b-5p能夠顯著下調(diào)IL-10和TLR4的基因的表達。因此,rno-miR-30b-5p可通過調(diào)控IL-10、TLR4表達水平,調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)展進程。本研究為進一步探索microRNA在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展進程中的調(diào)控作用以及治療葡萄膜炎奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R773.9
【部分圖文】：

外周血,患者,葡萄膜炎,健康人