背景 年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是黃斑區(qū)結(jié)構(gòu)的衰老病變，多發(fā)生于45歲以上人群，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是發(fā)達(dá)國家老年人致盲的主要原因。其主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)對視細(xì)胞外節(jié)盤膜吞噬消化能力下降，使其潴留于基底部細(xì)胞原漿中，并向細(xì)胞外排出，沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣或者引起B(yǎng)ruch膜斷裂，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管通過斷裂的Bruch膜進(jìn)入RPE下及視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮下區(qū)域，形成脈絡(luò)膜新生血管(CNV)，導(dǎo)致血管的滲漏和出血，進(jìn)而引發(fā)一系列繼發(fā)性病理改變。在AMD的早期，RPE為主要靶目標(biāo)，正常的RPE對于維持眼局部功能及組成血眼屏障(BRB)有重要意義，RPE細(xì)胞的功能紊亂可引起光感受器凋亡，在特定條件下還可產(chǎn)生促血管生成因子并最終參與脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的形成，這些血管侵入視網(wǎng)膜將導(dǎo)致中心視力的喪失。玻璃疣是AMD的早期臨床標(biāo)志并沉積于RPE下，玻璃疣刺激RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子被認(rèn)為是參與CNV形成的重要原因之一,而作為玻璃疣重要的成分之一，淀粉樣蛋白β（Aβ）在該過程中的作用及相關(guān)作用機(jī)制尚未完全明確。過去的研究已經(jīng)證明Aβ可以刺激RPE細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇，由于氧化應(yīng)激是促血管生成過程的重要調(diào)節(jié)因子，而線粒體相關(guān)活性氧簇在Aβ誘導(dǎo)的促血管生成過程中是否起作用尚不清楚。另一方面，過去的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明補(bǔ)體活性片段C3a，C5a也是玻璃疣的重要成分并可以促進(jìn)RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子和炎癥因子，而玻璃疣中C3a，C5a的產(chǎn)生是否與Aβ有關(guān)系，以及它們是否參與了Aβ誘導(dǎo)的新生血管的形成過程也并未進(jìn)行研究。 本研究基于上述背景，進(jìn)行了以下兩大方面的實(shí)驗(yàn)：1、探討Aβ對RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子的影響，驗(yàn)證其是否引起線粒體相關(guān)活性氧簇的上調(diào)以及誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生補(bǔ)體活性片段C3a，C5a；2、進(jìn)一步探討Aβ誘導(dǎo)的活性氧簇及補(bǔ)體片段的產(chǎn)生是否參與了最終促血管生成因子的分泌，探討Aβ對RPE細(xì)胞促血管生成因子影響的相關(guān)機(jī)制。通過上述研究，以期能對Aβ在AMD發(fā)病過程中的作用及相關(guān)作用機(jī)制有一個(gè)較為深入的了解，同時(shí)為AMD的預(yù)防和治療尋找到新的靶點(diǎn)和突破口。 目的： 探討淀粉樣蛋白β對ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成因子、活性氧簇、補(bǔ)體活性片段C3a，C5a的影響，及淀粉樣蛋白β引起的活性氧簇及補(bǔ)體片段C3a，C5a是否參與了其誘導(dǎo)產(chǎn)生促血管生成因子分泌的過程。 方法： 將由ATCC（American Type Culture Collection）購買的ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、種板，分別用不同濃度的Aβ（1-42）、對照反向無活性蛋白Aβ（42-1）及空白對照DMSO刺激24小時(shí)，收集培養(yǎng)上清后用ELISA的方法分別檢測促血管生成因子VEGF、IL-8、MCP-1的表達(dá)水平；使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測線粒體相關(guān)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生水平；使用ELISA的方法檢測補(bǔ)體活性片段C3a，C5a的表達(dá)情況。在用不同濃度的Aβ(1-42)刺激細(xì)胞前預(yù)先分別加入活性氧阻斷劑DPI或者C3a，C5a中和抗體預(yù)孵，然后加入刺激劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)上清后用ELISA的方法分別檢測相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中促血管生成因子VEGF、IL-8、MCP-1的表達(dá)水平及補(bǔ)體活性片段C3a，C5a的表達(dá)情況。CCK-8實(shí)驗(yàn)用以研究Aβ(1-42)和DPI對ARPE-19細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果： 1. Aβ(1-42), Aβ(42-1)和DMSO分別處理ARPE-19細(xì)胞24小時(shí)后檢測發(fā)現(xiàn)Aβ(1-42)處理組的VEGF, IL-8，MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯高于Aβ(42-1)和DMSO處理組。 2.以Aβ(1-42), Aβ(42-1)和DMSO分別處理ARPE-19細(xì)胞24小時(shí)后流式檢測發(fā)現(xiàn)20μM Aβ(1-42)處理組的線粒體相關(guān)活性氧簇有明顯升高，而1μM，10μMAβ(1-42)處理組及Aβ(42-1)和DMSO處理組未發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)活性氧簇的明顯升高。 3.不同濃度的Aβ(1-42), Aβ(42-1)和DMSO分別處理ARPE-19細(xì)胞24小時(shí)后收集培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)各濃度Aβ(1-42)處理組的C3a，C5a蛋白水平明顯高于Aβ(42-1)和DMSO處理組。 4.以活性氧阻斷劑DPI預(yù)處理的Aβ(1-42)刺激組和無DPI預(yù)處理的Aβ(1-42)刺激組相比較，其促血管生成因子VEGF, IL-8，MCP-1及補(bǔ)體活性片段C3a，C5a蛋白表達(dá)水平明顯下降。 5.以C3a，C5a中和抗體預(yù)處理的不同濃度Aβ(1-42)刺激組和無中和抗體預(yù)處理的Aβ(1-42)刺激組相比較，促血管生成因子VEGF,IL-8，MCP-1蛋白表達(dá)水平未見明顯差異。 6.本實(shí)驗(yàn)中用到的各濃度Aβ(1-42)對細(xì)胞活性無明顯影響。5μM的DPI對細(xì)胞活性無明顯影響，而10μM以上濃度的DPI可明顯降低細(xì)胞活性。 結(jié)論： 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Aβ通過促進(jìn)RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子VEGF, IL-8, MCP-1參與CNV的形成，同時(shí)驗(yàn)證了Aβ可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇，分泌補(bǔ)體活性片段C3a，C5a。線粒體相關(guān)活性氧簇參與了Aβ誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子過程及C3a，C5a的分泌。盡管Aβ可以誘導(dǎo)RPE細(xì)胞產(chǎn)生C3a，C5a，但它們并不參與促血管生成因子的形成。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R774.5
【部分圖文】：

圖 1-1 VEGF 蛋白表達(dá)水平（**，p<0.01）Fig 1-1 ELISA assay of VEGF protein expression Aβ(1-42)刺激的 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 MCP-1,IL-8 蛋白平明顯升高過去的研究已經(jīng)驗(yàn)證了單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和白介素-8(IL-8)是可通過趨化炎癥細(xì)胞(如：中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等) 直接或間接促進(jìn)新成的細(xì)胞因子[24,25]，且可以參與到 CNV 的形成過程中，因此，我們進(jìn)一 Aβ(1-42)刺激的 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 MCP-1,IL-8 的蛋白表達(dá)水平找 Aβ(1-42)刺激組與對照組相比較 MCP-1, IL-8 蛋白水平的表達(dá)差異。：Aβ(1-42)刺激的 ARPE-19 細(xì)胞組培養(yǎng)上清中 MCP-1, IL-8 蛋白水平明

1-2A ELISA 法檢測 MCP-1 蛋白表達(dá)水平（**，p<0.01；*，p<0.05Fig 1-2A ELISA assay of MCP-1 protein expressionB**********

3 CCK-8 法檢測各濃度 Aβ(1-42)對 ARPE-19 細(xì)胞存活率的-3 CCK-8 assay to test the influence of Aβ(1-42) on ARPE-viability疣是 AMD 的早期臨床特征，由于淀粉樣蛋白β是玻璃疣的且考慮到 Aβ在 AMD 發(fā)病過程中的作用，大量研究開始探中可能的機(jī)制。這些研究揭示了 Aβ對 RPE 細(xì)胞分泌細(xì)胞因 Aβ可以促進(jìn)某些促血管生成因子和炎癥因子在基因水平D 終末 CNV 形成有關(guān)[21-25]。我們的研究表明 Aβ(1-42)可促GF,MCP-1，IL-8蛋白。Cao 等的研究顯示了 Aβ(1-42)可促進(jìn)-8[38]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，而 Andersons 等的研究
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本文編號：2853687