第一部分大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞的原代培養(yǎng)及葡萄糖氧化酶誘導的氧化應激模型的建立目的:大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞(marginal cells,MCs)的原代培養(yǎng)及葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)誘導的MCs氧化應激模型的建立。方法:取SD大鼠乳鼠(3日齡),麻醉斷頭后,在解剖顯微鏡下分離去除兩側的顳骨,可見透明的骨性耳蝸,并分離出耳蝸側壁的血管紋組織。經(jīng)酶消化后加入血清濃度為2%的動物上皮細胞培養(yǎng)基中,接種于細胞培養(yǎng)板并置于37℃,5%CO_2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)選擇性消化和差速貼壁方法純化MCs后,用倒置顯微鏡每日觀察MCs形態(tài)并采用免疫熒光的方法鑒定MCs。將MCs置于新鮮動物上皮細胞培養(yǎng)基中并加入5 mM葡萄糖(glucose,G),分別用不同濃度的GO處理,用CCK-8試劑盒篩選出最適宜的作用濃度。再分別用相同濃度的GO處理MCs不同的時間,用CCK-8試劑盒篩選出最適宜的作用時間。為進一步驗證氧化應激模型的建立,通過流式細胞儀檢測相同濃度的GO不同時間點下MCs內的ROS水平。結果:倒置顯微鏡下觀察到MCs貼壁生長,多角形外觀,排列緊密,界限清晰,呈現(xiàn)單層“鋪路石樣”外觀。免疫熒光方法檢測MCs內角蛋白18(CK-18)陽性。CCK-8檢測結果顯示GO濃度大于20 U/L時能夠引起MCs活性下降,GO濃度處于20-50 U/L之間時雖然能夠導致MCs活性下降,但沒有統(tǒng)計學意義,GO濃度為60 U/L時顯著降低MCs活性(P﹤0.01),因此選用60 U/L GO處理MCs。用60 U/L的GO分別干預MCs 0 h、2 h、4 h、6 h及8 h,MCs活性逐漸降低,但2 h組較對照組相比無統(tǒng)計學意義,4 h組較對照組相比有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01),6 h組和8 h組雖然也具有統(tǒng)計學意義,但MCs活性較低,狀態(tài)較差。因此后續(xù)實驗選用60 U/L的GO干預MCs 4h。用60 U/L GO處理MCs,流式細胞儀檢測結果顯示MCs內ROS水平呈時間依賴性升高。結論:成功的培養(yǎng)出大鼠耳蝸血管紋MCs,得到較高純度的MCs。用60 U/L GO作用于MCs 4 h后建立了體外MCs氧化應激模型。第二部分葡萄糖氧化酶誘導邊緣細胞Parthanatos目的:研究PARP-1在葡萄糖氧化酶(GO)誘導的耳蝸血管紋邊緣細胞(MCs)氧化應激損傷中的作用及其可能的分子機制。方法:將MCs置于新鮮動物上皮細胞培養(yǎng)基中并加入5 m M葡萄糖(G),用60 U/L GO處理純化后的MCs,通過Western blot和免疫熒光的方法檢測MCs內PAR蛋白水平和表達分布情況、線粒體凋亡誘導因子AIF胞內表達變化以及PARP-1的表達變化。通過JC-1染色檢測線粒體膜電位(MMP)的變化情況。通過PARP-1 si RNA轉染下調PARP-1的表達來明確PARP-1在葡萄糖氧化酶誘導的邊緣細胞Parthanatos中的作用,轉染MCs(MOI=30)后將分為以下四組:對照組、GO、GO+Ad-Con、GO+Ad-PARP-1-RNAi。通過Annexin V/PI雙染檢測MCs的死亡情況。結果:Western blot結果顯示,隨著GO處理時間的延長,MCs內PAR蛋白水平依次增加,免疫熒光結果顯示GO處理組的MCs內PAR表達水平增加,且主要表達于細胞質。與對照組相比,GO處理組的MCs內AIF線粒體蛋白水平降低(P﹤0.05),細胞漿和細胞核內AIF蛋白水平升高(P﹤0.01,P﹤0.05);PARP-1在線粒體、細胞漿和細胞核內蛋白水平升高(P﹤0.01,P﹤0.05,P﹤0.05);免疫熒光結果顯示GO處理組的MCs核內AIF水平升高,發(fā)生了細胞核轉位;JC-1染色結果顯示GO處理組的MCs內MMP隨著GO處理時間的增加不斷下降,導致了線粒體去極化;流式細胞儀結果顯示PARP-1 si RNA轉染MCs后,與GO+Ad-Con組相比,GO+Ad-PARP-1-RNAi組的PI陽性率降低(P﹤0.05);MMP升高(P﹤0.01);PAR蛋白表達水平降低(P﹤0.05);AIF在線粒體內的蛋白表達水平升高(P﹤0.05),在細胞漿和細胞核內蛋白表達水平降低(P﹤0.05,P﹤0.05);PARP-1在線粒體、細胞漿和細胞核內蛋白表達水平降低(P﹤0.01,P﹤0.05,P﹤0.05);與GO+Ad-Con組相比,免疫熒光結果顯示GO+Ad-PARP-1-RNAi組AIF沒有出現(xiàn)明顯的細胞核轉位現(xiàn)象。結論:在GO誘導的耳蝸血管紋MCs氧化應激損傷過程中PARP-1明顯激活,PAR積聚,AIF由線粒體向細胞核的轉位,MMP明顯下降,誘導了MCs Parthanatos;PARP-1 si RNA轉染可抑制MCs Parthanatos,明確了PARP-1在GO誘導的MCs Parthanatos中的重要作用。第三部分探討PARP-1對葡萄糖氧化酶誘導的自噬的調節(jié)以及自噬對邊緣細胞Parthanatos的影響目的:探討葡萄糖氧化酶(GO)是否能夠誘導自噬的表達,PARP-1是否參與自噬的調節(jié)以及自噬對GO誘導的MCs Parthanatos的影響。方法:將MCs置于新鮮動物上皮細胞培養(yǎng)基中并加入5 m M葡萄糖(G),用60 U/L GO處理純化后的MCs,在不同的時間點通過Western blot檢測自噬標志性蛋白LC3和P62表達水平的變化;用60 U/L GO處理純化后的MCs之前,給予自噬抑制劑3-MA 10m M,通過Western blot和免疫熒光的方法檢測自噬流的變化,給予自噬抑制劑3-MA后將分為以下四組:對照組、3-MA組、GO組、GO+3-MA組;通過PARP-1 si RNA轉染下調PARP-1的表達明確PARP-1是否參與自噬的調控,通過Western blot檢測自噬標志性蛋白LC3和P62表達水平的變化,轉染MCs后將分為以下四組:對照組、GO組、GO+Ad-Con、GO+Ad-PARP-1-RNAi;通過Annexin V/PI雙染檢測MCs死亡情況;通過JC-1染色檢測線粒體膜電位(MMP)的變化情況;通過Western blot檢測PAR蛋白表達變化;通過Western blot檢測AIF和PARP-1分別在線粒體、細胞漿和細胞核內蛋白表達變化。結果:Western blot結果顯示,隨著GO處理時間的延長,LC3-Ⅱ的表達水平逐漸增加,P62的表達水平逐漸降低;Western blot結果顯示,與GO組相比,GO+3-MA組的LC3-Ⅱ的蛋白表達水平降低(P﹤0.05),P62的蛋白表達升高(P﹤0.05),免疫熒光檢測結果顯示,與GO組相比,GO+3-MA組的LC3斑點狀熒光明顯減少;Western blot結果顯示,與GO+Ad-Con組相比,GO+Ad-PARP-1-RNAi組的LC3-Ⅱ的表達水平降低(P﹤0.05),P62的表達水平增加(P﹤0.05);與GO組相比,流式細胞儀結果顯示,GO+3-MA組的PI陽性率升高(P﹤0.05),MMP降低(P﹤0.01);PAR蛋白表達水平升高(P﹤0.05);AIF在線粒體內的蛋白表達水平降低(P﹤0.05),在細胞漿和細胞核內蛋白表達水平升高(P﹤0.05,P﹤0.05);PARP-1在線粒體、細胞漿和細胞核內蛋白表達水平升高(P﹤0.05,P﹤0.05,P﹤0.05)。結論:GO處理MCs能夠誘導自噬增加;PARP-1 si RNA轉染下調PARP-1的表達能夠抑制自噬表達;抑制自噬可促進MCs Parthanatos,說明自噬在在GO誘導的耳蝸血管紋MCs氧化應激損傷過程中起著保護性作用。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R764
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文實驗結果MCs 形態(tài)學觀察鏡下可見原代培養(yǎng)的耳蝸血管紋 MCs。貼壁后的 MCs 呈多角形，細胞離，大小不一，彼此界限清楚。細胞之間緊密連接，細胞相互融合成排皮層，呈“鋪路石”樣的外觀。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，MCs 體積逐漸增多，呈“泡沫樣”的外觀，胞核變淡，胞質中可見顆粒樣的物質。可的形成。

MCs的鑒定CK-18在MCs內表達陽性

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文．GO 處理之后 MCs 的活性了篩選出適宜的 GO 作用濃度，用加入 5 mM 葡萄糖的新鮮培養(yǎng)基配置 GO,其濃度分為 0 U/L, 10 U/L, 20 U/L, 30 U/L, 40 U/L, 50 U/L, 60 U/L, 70 U/L, 80 U/ 100 U/L，干預 4 h，干預結束后通過 CCK-8 檢測 MCs 活性。如圖 3A 所示，GO 濃大于 20 U/L 時能夠引起 MCs 活性下降，GO 濃度處于 20-50 U/L 之間時雖然能夠導 MCs 下降，但沒有統(tǒng)計學意義，GO 濃度為 60 U/L 時顯著降低 MCs 活性（P﹤0.01）續(xù)實驗我們選用 60 U/L 的 GO 干預 MCs。如圖 3B 所示，隨著 GO 作用時間的延長，Cs 活性逐漸降低，但 2 h 組較對照組相比無統(tǒng)計學意義，4 h 組較對照組相比有統(tǒng)學意義（P﹤0.01），6 h 組和 8 h 組雖然也具有統(tǒng)計學意義，但細胞活性較低，狀較差。因此后續(xù)實驗選用 60 U/L 的 GO 干預 MCs 4 h。
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本文編號：2845782