角膜病是當(dāng)今世界重要的致盲性眼病之一,國內(nèi)外目前對于角膜內(nèi)皮失代償疾病導(dǎo)致的角膜病盲主要還是用各種類型的角膜移植手術(shù)這一比較傳統(tǒng)的治療方法,但是供體來源的匱乏這一世界難題一直未曾得到真正解決,所以尋找一種可以代替角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞或是方法,就成為角膜內(nèi)皮疾病研究的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)嘗試通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能,選用恒河猴10 只,全麻后取恒河猴自體(BMSCs:Bone marrow mesenchymal stem cells)和恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞(CECs:Corneal endothelial cells),進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定。按照誘導(dǎo)方式的不同將恒河猴BMSCs分為6個實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)的恒河猴BMSCs及CECs為正常對照組,分別對6個實(shí)驗(yàn)組的恒河猴BMSCs給予不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)分化,并分別對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察及檢測細(xì)胞因子和標(biāo)志性蛋白的表達(dá)變化,對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的恒河猴BMSCs之間的差異進(jìn)行對比,觀察哪一種誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)分化后的恒河猴BMSCs更加接近角膜內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)恒河猴BMSCs在不同誘導(dǎo)條件下(在一定濃度范圍內(nèi)增加培養(yǎng)基中的房水濃度、恒河猴BMSCs與恒河猴CECs直接接觸共培養(yǎng)、恒河猴BMSCs與CECs間接共培養(yǎng)、恒河猴BMSC與恒河猴(CEC-CM)接觸共培養(yǎng))均有向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化的潛能;恒河猴BMSCs與自體晶體勻漿液接觸共培養(yǎng)后向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化的趨勢不明顯,恒河猴BMSCs中加入虹膜組織提取物培養(yǎng)后無向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化趨勢和潛能、并且虹膜組織對于恒河猴BMSCs生長、增殖有明顯的抑制作用。對恒河猴BMSCs分化為CECs的可行性和影響因素進(jìn)行初步分析研究。為下一步應(yīng)用自體BMSCs誘導(dǎo)分化治療人類角膜內(nèi)皮功能失代償疾病奠定重要的理論基礎(chǔ)。同時本實(shí)驗(yàn)成功的對恒河猴CEC進(jìn)行了在體外的分離培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇,為恒河猴CECs的體外培養(yǎng)、鑒定、凍存提供了成功經(jīng)驗(yàn)。[目的]利用恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)具有的多向分化潛能,擬通過將恒河猴的BMSCs與角膜內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)體外共培養(yǎng),并分別加入不同配方的培養(yǎng)液,誘導(dǎo)恒河猴BMSCs向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。對分化的恒河猴BMSCs和培養(yǎng)的CECs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、超微結(jié)構(gòu)分析、特異性表面分子和蛋白表達(dá)的檢測、誘導(dǎo)分化過程中特定細(xì)胞因子的變化的檢測。驗(yàn)證恒河猴BMSCs誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的可能性,同時對比不同誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)結(jié)果。探討影響誘導(dǎo)分化的因素和尋找BMSCs誘導(dǎo)分化的最佳條件,為下一步應(yīng)用自體BMSCs誘導(dǎo)分化治療人類角膜內(nèi)皮功能失代償疾病奠定一定的理論基礎(chǔ)。[方法]本實(shí)驗(yàn)選用恒河猴10只,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物研究所靈長類研究中心提供,雌雄兼有,年齡16-28個月,體重4-6.5公斤。全麻后取恒河猴自體BMSCs和CECs進(jìn)行分離培養(yǎng),并通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)記物、和進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化[1]證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所提取分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),通過神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)免疫組化檢測和對分離提取的恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面特異性蛋白免疫熒光染色鑒定[2]證明本次實(shí)驗(yàn)所分離提取的細(xì)胞是恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)誘導(dǎo)方法的不同將恒河猴BMSCs分為6個實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)的恒河猴BMSCs及CECs為正常對照組。對分別對6個實(shí)驗(yàn)組的河猴BMSCs給予不同的誘導(dǎo)條件,對恒河猴BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化后,觀察恒河猴BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及檢測誘導(dǎo)后的恒河猴BMSCs細(xì)胞表面特異性蛋白表達(dá)變化。探討恒河猴BMSCs細(xì)胞分化為CECs細(xì)胞可行性和影響因素。[結(jié)果]1.成功實(shí)現(xiàn)了恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外的分離、培養(yǎng)和鑒定,其細(xì)胞形態(tài)非常典型;恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)多次傳代(6次傳代)培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇后生長狀態(tài)良好、細(xì)胞形態(tài)典型,而且角膜內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)陽性、細(xì)胞離子泵Na+-K+-ATP酶蛋白表達(dá)陽性、細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1蛋白表達(dá)陽性,證明本次實(shí)驗(yàn)所分離提取的細(xì)胞是恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞。2.不同培養(yǎng)條件對恒河猴BMSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果2.1不同房水濃度對恒河猴BMSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果:在15%和25%兩種不同房水濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的恒河猴BMSCs細(xì)胞形狀有向多邊形變化的趨勢,排列變得松散,兩組細(xì)胞分別進(jìn)行NSE染色細(xì)胞內(nèi)均可見粗大的棕色顆粒。ZO-1熒光染色顯示:見細(xì)胞核被DAPI著染為藍(lán)色、細(xì)胞膜和胞漿染色未見明顯的綠色熒光、染色結(jié)果弱陽性,Na+-K+-ATP熒光染色顯示:見細(xì)胞核被DAPI著染為藍(lán)色、細(xì)胞膜和胞漿可見明顯的紅色熒光著染,染色陽性。2.2恒河猴BMSCs與CECs直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化結(jié)果恒河猴BMSCs與CECs直接接觸共培養(yǎng)后,可見長梭形恒河猴BMSCs貼壁生長、行NSE染色細(xì)胞內(nèi)均可見粗大的棕色顆粒。行Z0-1熒光染色后細(xì)胞膜和胞漿輕度染為綠色,染色弱陽性,Na+-K+-ATP熒光染色后細(xì)胞膜和胞漿見紅色著染,染色陽性。2.3恒河猴BMSCs/CECs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化結(jié)果恒河猴BMSCs與恒河猴CECs間接接觸共培養(yǎng)20h,可見長梭形BMSCs貼壁生長,行NSE染色后細(xì)胞內(nèi)均可見粗大的棕色顆粒見。Z0-1熒光染色:細(xì)胞膜和胞漿輕度染為綠色,染色弱陽性,Na+-K+-ATP免疫熒光染色:細(xì)胞膜和胞漿見紅色著染,染色陽性。2.4晶狀體上皮提取物誘導(dǎo)恒河猴BMSCs分化結(jié)果根據(jù)是否與晶狀體上皮提取物接觸誘導(dǎo)再分為:恒河猴BMSCs與晶狀體上皮提取物非接觸共培養(yǎng)組和BMSCs與晶狀體上皮提取物直接接觸共培養(yǎng)組。與晶狀體上皮提取物非接觸共培養(yǎng)組共培養(yǎng)14h可見細(xì)胞變寬、形狀有向多邊形方向分化的趨勢,NSE染色細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒著染不明顯,與空白對照CECs組比較細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒著染明顯減少。ZO-1免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿染色未見明顯的綠色熒光、Z0-1熒光染色結(jié)果陰性;Na+-K+-ATP酶免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿見明顯的紅色顆粒狀熒光著染,Na+-K+-ATP酶免疫熒光染色結(jié)果陽性。恒河猴BMSCs與晶狀體上皮提取物直接接觸共培養(yǎng)組共培養(yǎng)14h、可見細(xì)胞變寬、排列松散、形狀有向多邊形方向分化的趨勢,但是細(xì)胞數(shù)量較非接觸共培養(yǎng)組細(xì)胞密度低,NSE染色細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒著染不明顯,與CECs組比較細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒著染明顯減少。ZO-1免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿染色未見明顯的綠色熒光、Z0-1熒光染色結(jié)果陰性;Na+-K+-ATP酶免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿見明顯的紅色顆粒狀熒光著染,Na+-K+-ATP酶免疫熒光染色結(jié)果陽性。2.5虹膜組織對于恒河猴BMSCs的誘導(dǎo)分化結(jié)果根據(jù)是否與虹膜組織接觸誘導(dǎo)再分為:恒河猴BMSCs與虹膜組織非接觸共培養(yǎng)組和BMSCs與虹膜組織接觸共培養(yǎng)組。與虹膜組織非接觸共培養(yǎng):可見少量梭形BMSCs貼壁生長、細(xì)胞密度明顯降低未見明顯向多邊形方向分化的趨勢,NSE染色細(xì)胞內(nèi)未見明顯的棕色顆粒著染、NSE染色陰性。與虹膜組織直接接觸共培養(yǎng)14d倒置相差顯微鏡拍攝:未見細(xì)胞生長、只見虹膜色素顆粒,行NSE染色只見恒河猴BMSCs細(xì)胞碎片和虹膜顆粒。恒河猴BMSCs與虹膜組織非接觸共培養(yǎng)后Z0-1熒光染色細(xì)胞核被DAPI著染為藍(lán)色但是細(xì)胞膜和胞漿未見明顯染色,BMSC細(xì)胞與虹膜組織非接觸共培養(yǎng)后Na+-K+-ATP熒光染色細(xì)胞膜和胞漿未見染色,熒光染色陰性。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)恒河猴BMSCs與虹膜直接觸共培養(yǎng)后恒河猴BMSCs的生長明顯受到抑制,未見存活細(xì)胞所以無法進(jìn)行免疫熒光染色檢查。2.6 恒河猴BMSCs與角膜內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CEC-CM:Corneal endothelial c ells Conditioned medium)接觸共培養(yǎng):恒河猴BMSCs與角膜內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CEC-CM)接觸共培養(yǎng)后細(xì)胞形狀變寬、排列變疏松,細(xì)胞外形有向多邊形分化的趨向,NSE免疫組化染色細(xì)胞內(nèi)可見粗大的棕色顆粒、NSE免疫組化染色結(jié)果陽性。Z0-1蛋白免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿輕度著染為綠色熒光、染色弱陽性,Na+-K+-ATP酶蛋白免疫熒光染色顯示:細(xì)胞膜和胞漿見明顯的紅色熒光著染、染色陽性。[結(jié)論]恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞能成功實(shí)現(xiàn)在體外的分離培養(yǎng)凍存,改進(jìn)的揭膜聯(lián)合蛋白酶消化法是一種可重復(fù)性高、可靠性強(qiáng)的CECs提取方法,并能夠顯著提高恒河猴CEC細(xì)胞培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇的成功率,為恒河猴CECs的體外培養(yǎng)、鑒定、凍存提供了成功的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。在一定濃度范圍內(nèi)增加培養(yǎng)基中的房水濃度有利于BMSCs在向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化;恒河猴BMSCs與CECs直接接觸共培養(yǎng)后恒河猴BMSCs表現(xiàn)出向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的趨勢和潛能;恒河猴B MSCs與CECs間接共培養(yǎng)后BMSCs有向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化的潛能;恒河猴BMSCs與(CECs-CM)接觸共培養(yǎng)后均有向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化的趨勢和潛能;BMSCs與晶體勻漿液共培養(yǎng)后向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化的趨勢不明顯。恒河猴BMSCs培養(yǎng)基中加入虹膜提取物培養(yǎng)后,恒河猴BMSCs沒有向類角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化趨勢和潛能,并且恒河猴BMSCs的生長增殖明顯受到抑制。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R77
【部分圖文】：

圖１邋Ｐ０代恒河猴ＢＭＳＣｓ邋（１００Ｘ邋）

５．１骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ＢＭＳＣｓ）逡逑（１）細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)逡逑將原代培養(yǎng)的恒河猴ＢＭＳＣｓ接種于Ｔ２５ｃｍ２培養(yǎng)瓶后即刻觀察，細(xì)胞形狀呈逡逑橢圓型，細(xì)胞個體大小不均，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。２４ｈ后部分細(xì)胞開始發(fā)生貼逡逑壁，貼壁的細(xì)胞呈現(xiàn)梭形。經(jīng)過更換細(xì)胞培養(yǎng)液去除未貼壁的其他細(xì)胞或是死亡逡逑的恒河猴ＢＭＳＣｓ，４８ｈ后可見貼壁生長的細(xì)胞呈現(xiàn)短梭形、星形。原代細(xì)胞生長逡逑速度相對較緩慢，細(xì)胞生長５－６ｈ可見５－６個漩渦狀分布的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞的突起逡逑表現(xiàn)為長短不一、粗細(xì)不均，培養(yǎng)７－８ｈ后細(xì)胞集落生長，排列緊密，逐漸融合逡逑成片達(dá)到８０％＿９０％融合，進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖１）。Ｐ１代恒河猴ＢＭＳＣｓ傳代細(xì)胞４－６ｈ逡逑開始出現(xiàn)貼壁，２４ｈ全部完成貼壁生長。６ｄ細(xì)胞融合９０％，可傳代１次。可穩(wěn)定逡逑連續(xù)傳代１５代以上，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，Ｐ６－１０代細(xì)胞生長速度略微減慢，逡逑７－８ｄ傳代一次（圖２－４）。逡逑

．■鏟，邐’邐＾邋ｔ邋ｉ邋＾邐‘：邋？邋：》５邐免’邐”哶？逡逑圖３邋Ｐ３代恒河猴ＢＭＳＣｓ邋（１００Ｘ邋）邐圖４邋Ｐ３代恒河猴ＢＭＳＣｓ邋（１００Ｘ邋）逡逑（２）邋ＢＭＳＣｓ的鑒定及標(biāo)記逡逑（２．１）經(jīng)過流式細(xì)胞儀對第三代恒河猴ＢＭＳＣｓ表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測：本次分逡逑離提取的恒河猴ＢＭＳＣｓ表面ＣＤ９０抗原表達(dá)的陽性率為９８．邋８％邋（圖５）、ＣＤ２９陽性逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2833333