背景真菌性角膜炎(Fungal keratitis,FK)是一類由真菌感染而引發(fā)機(jī)體角膜組織發(fā)生炎癥反應(yīng)性疾病。本病是由Leber于1878年首次報(bào)道,是一類常見的、較頑固的真菌感染。由于本病早期診斷及治療困難,常導(dǎo)致患者角膜潰瘍或穿孔,進(jìn)展為眼內(nèi)炎,引發(fā)視力障礙或失明。近年來,由于在臨床上大量使用抗生素、皮質(zhì)類激素、免疫抑制劑等藥物,我國真菌性角膜炎在人群中發(fā)病率呈逐年增高趨勢,以男性及農(nóng)村居民感染為主,繼白內(nèi)障之后成為首要致盲性眼病~([1]),給人們家庭及社會發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。鐮刀菌和曲霉毒是引起眼部真菌感染的主要菌種,而曲霉菌引起的眼感染癥中主要是由感染煙曲霉菌和黃曲霉菌所致。在一些地區(qū)真菌角膜感染已經(jīng)成為主要的致病原~([2])。目前,臨床上真菌感染的患者很多,然而治療真菌性角膜炎的有效藥物卻很少,并且治療比較困難。因此,深入研究本病的病原學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、診斷學(xué)和流行病學(xué),對本病的早期診斷和防治有著重要的意義。角膜呈球冠型,中央薄,邊緣厚,自外向內(nèi)由5層角膜細(xì)胞和結(jié)締組織所構(gòu)成,其機(jī)械屏障可以抵御真菌的感染。角膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞也可以通過表達(dá)一些模式識別受體(PRRs),通過病原相關(guān)分子模式(PAMPs)激活人體的固有免疫,誘導(dǎo)特異的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,以清除病原體~([3]),修復(fù)病原對人體的損害。Ariizumi等人于2000年首次發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-l(Dentritk cell associated C Type lectin-1,Dectin-1)~([4]),后者是樹突狀細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體,并且廣泛分布于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞以及部分T細(xì)胞亞群等。同時(shí),在鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上亦有表達(dá)~([5])。最近有研究表明,Dectin-l能夠識別真菌、細(xì)菌表面的β-1、3/β-1、6-葡聚糖和碳水化合物。在真菌感染過程中,Dectin-l參與Th17細(xì)胞的產(chǎn)生,后者能夠分泌產(chǎn)生IL-6、IL-17A、TNF-ɑ和IL-17F等細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子可以動員、募集及活化中性粒細(xì)胞,對抗細(xì)胞外真菌及細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17能有效地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動員的興奮過程,從而有效地誘導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)。由于Tyr238X突變使得Dectin-l不能在細(xì)胞膜上表達(dá),減少了IL-17的產(chǎn)生,增加了真菌感染的易感性~([6][7][8])。而IL-12和TNF-α因子在抗真菌感染反應(yīng)中也發(fā)揮重要的作用。Dectin-1受體是一類跨膜結(jié)構(gòu),屬于C型凝集素受體家族中的一員,其能夠識別外源性病原菌,例如真菌和分歧桿菌等,也能夠識別T細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性配體。由于這一受體能夠識別真菌,因此在真菌性角膜炎患者體內(nèi)能夠被發(fā)現(xiàn)。而在對患者實(shí)施臨床診斷和治療時(shí),也可通過干預(yù)Dectin-1受體作用而達(dá)到良好的效果。但需注意的是,當(dāng)前我國在對真菌性角膜炎患者的臨床診治研究中,對Dectin-1受體已有一些研究,但需要更深入的探討,正是據(jù)此本文開展這方面的研究。目的本文擬探討真菌性角膜炎動物模型建立后大鼠角膜的病理變化,Dectin-1受體的表達(dá)水平,以及Dectin-1受體與IL-17、IL-12和TNF-α等多種細(xì)胞因子之間的關(guān)系,以期揭示Dectin-1受體在抗真菌性角膜炎免疫應(yīng)答中的作用和機(jī)制,為臨床上診治真菌性角膜炎,尋找新的治療靶點(diǎn)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法一、動物模型建立1.實(shí)驗(yàn)動物與分組選取由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的60只Wistar清潔級、健康大鼠,雌雄不限、8周齡,體重在200g-250g之間,經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢測后眼部角膜組織均沒有結(jié)構(gòu)和功能病變。將這些大鼠分為三組:實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對照組,每組分別為25只、25只和10只。2.模型建立(1)采用中國普通微生物菌種保藏管理中心提供的煙曲霉菌菌株(編號為3.0772),制備成濃度為1×10~8個菌絲/毫升的菌懸液。(2)分別測定實(shí)驗(yàn)大鼠的眼部角膜曲率半徑,計(jì)算平均值作為最終值,將封口膜制備成相應(yīng)曲率半徑的角膜接觸鏡,并使用濃度為75%的乙醇進(jìn)行浸泡消毒。(3)實(shí)驗(yàn)組1的25只大鼠眼部給予Dectin-1特異性抑制劑昆布多糖(Laminarin)處理;實(shí)驗(yàn)組2的25只大鼠眼部給予生理鹽水處理,不使用昆布多糖(Laminarin)。(4)實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的50只大鼠,均在角膜中部區(qū)域鉆大約2mm的圓形印痕。(5)將菌懸液滴在實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2大鼠的角膜上,用制備好的角膜接觸鏡進(jìn)行覆蓋,縫合眼瞼,保證大鼠感染目標(biāo)菌株,建立真菌性角膜炎大鼠動物模型。二、實(shí)驗(yàn)方法在建立真菌性角膜炎動物模型后,在第1天、第2天、第3天和第5天,分別取對照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2的大鼠角膜上皮組織。1.HE染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察;2.采用免疫組化法檢測各組大鼠角膜組織中Dectin-1的表達(dá)量;3.提取和收集RNA,采用QRT-PCR技術(shù)分別測定并比較各組大鼠Dectin-1、TNF-α、IL-17、IL-12的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果1.病理學(xué)結(jié)果對照組大鼠的角膜完整、沒有水腫和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2大鼠角膜可見水腫增厚、潰瘍處上皮缺失前彈力層、前房及基質(zhì)中有較多中性粒細(xì)胞浸潤。2.免疫組化結(jié)果對照組和實(shí)驗(yàn)組1的大鼠角膜組織中dectin-1受體的表達(dá)始終呈弱陽性;真菌感染1天后,實(shí)驗(yàn)組2的大鼠角膜組織中dectin-1受體的表達(dá)就開始呈現(xiàn)強(qiáng)陽性,一直持續(xù)到第5天。3.QRT-PCR檢測結(jié)果(1)對照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2大鼠角膜組織中都有Dectin-1、TNF-α、IL-12的表達(dá)。(2)在對照組和實(shí)驗(yàn)組1大鼠角膜組織中均沒有IL-17的表達(dá)。(3)實(shí)驗(yàn)1天后,實(shí)驗(yàn)組2大鼠角膜組織細(xì)胞中Dectin-1的表達(dá)量比對照組和實(shí)驗(yàn)組1明顯增加(P0.05),實(shí)驗(yàn)組1大鼠角膜組織中Dectin-1的表達(dá)量與對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(4)實(shí)驗(yàn)組1大鼠角膜組織中IL-12、TNF-α的表達(dá)量比對照組明顯增加(P0.05)。(5)實(shí)驗(yàn)組2大鼠角膜組織中IL-12的表達(dá)量在第1天到第3天持續(xù)增加,而TNF-α的表達(dá)量在第1天到第5天持續(xù)增加。結(jié)論1.在真菌感染后,大鼠角膜組織中的Dectin-1表達(dá)量增加,Dectin-1的表達(dá)量可能和炎癥反應(yīng)的應(yīng)答程度密切相關(guān)。2.IL-17的合成可能依賴于Dectin-l受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路。3.IL-12可能在真菌感染的早期發(fā)揮作用,Dectin-l受體參與炎癥因子IL-12的表達(dá),IL-12還受其他類型的細(xì)胞受體所誘導(dǎo)。4.TNF-α因子參與真菌性角膜炎角膜組織炎癥反應(yīng),且該因子的表達(dá)水平和Dectin-1受體沒有顯著的關(guān)系,其可能經(jīng)細(xì)胞上的其他受體誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所調(diào)控。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R772.21
【部分圖文】：

（三）結(jié)果1.蘇木素/伊紅染色結(jié)果對照組大鼠的角膜完整、沒有水腫和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；在實(shí)驗(yàn)組 2 大鼠中，經(jīng)蘇木素/伊紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第一天時(shí)大鼠的角膜發(fā)生水腫，潰瘍附近上皮組織結(jié)構(gòu)未改變，存在較少的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象（見圖 1a）；在第二天時(shí)大鼠的角膜水腫癥狀明顯加重，潰瘍組織上隆，局部基質(zhì)出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，且多數(shù)細(xì)胞屬于多形核細(xì)胞，角膜組織病灶局部后彈力層被破壞（見圖 1b）；在第三天時(shí)大鼠病灶處角膜損傷嚴(yán)重且已穿透彈力層，虹膜前粘，存在較多炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象（見圖 1c）；第五天時(shí)大鼠的角膜組織厚度降低，基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)疏松，浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)開始減少（見圖 1d）。實(shí)驗(yàn)組 1 角膜病理組織學(xué)與實(shí)驗(yàn)組 2 相似。

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、實(shí)驗(yàn)組 1 和實(shí)驗(yàn)組 2 大鼠的角膜上皮細(xì)胞中 Dectin-1 受體都存在表達(dá)，主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)。對照組和實(shí)驗(yàn)組1大鼠中Dectin-1受體的表達(dá)呈弱陽性。1天后，實(shí)驗(yàn)組2大鼠的Dectin-受體的表達(dá)呈強(qiáng)陽性。2.免疫組化檢測結(jié)果

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、實(shí)驗(yàn)組 1 和實(shí)驗(yàn)組 2 大鼠的角膜上皮細(xì)胞中 Dectin-1 受體都存在表達(dá)，主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)。對照組和實(shí)驗(yàn)組1大鼠中Dectin-1受體的表達(dá)呈弱陽性。1天后，實(shí)驗(yàn)組2大鼠的Dectin-受體的表達(dá)呈強(qiáng)陽性。2.免疫組化檢測結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2807892