發(fā)布時間：2020-08-15 16:39

【摘要】：葡萄膜炎是眼部炎性疾病的一種類型,視力喪失是其最常見的表現(xiàn)。在中國,白塞氏病(Behcet disease,BD)和Vogt-小柳原田綜合征(Vogt Koyanagi Harada,VKH)是葡萄膜炎類型中最常見的兩種疾病。Behcet病包括了血管炎性病變導(dǎo)致的葡萄膜炎、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍和生殖器潰瘍、多形性皮膚病變。VKH綜合征屬于自身免疫性疾病,最典型的特征是雙眼肉芽腫性葡萄膜炎,同時還常伴有腦膜刺激征、聽力下降、耳鳴、皮膚和毛發(fā)異常等。葡萄膜炎的治療主要是應(yīng)用皮質(zhì)類固醇和免疫抑制藥物,但是臨床中發(fā)現(xiàn)使用上述藥物具有嚴重的副作用,因此,闡明葡萄膜炎的發(fā)病機制對于開發(fā)更特異的藥物具有重要的意義。A20是在經(jīng)TNF-α處理后的臍靜脈內(nèi)皮細胞反應(yīng)中檢測到的一個誘導(dǎo)性表達蛋白,因此也被稱為TNF-α誘導(dǎo)蛋白3(TNF-α-induced protein 3,TNFAIP3)。在我們團隊的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A20基因中的rs9494885、rs10499194和rs7753873位點的多態(tài)性與Behcet病存在相關(guān),其中rs9494885與Behcet病存在強相關(guān);rs9494885位點的多態(tài)性與VKH綜合征存在密切相關(guān)。因此,我們將進一步研究A20在Behcet病和VKH綜合征中的發(fā)病機制。A20表達于多個免疫器官,包括胸腺、脾臟和腸相關(guān)免疫組織等。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是TOLL樣受體信號通路中的關(guān)鍵分子,其泛素化調(diào)節(jié)是NF-κB活化的關(guān)鍵因素,A20則通過對調(diào)節(jié)TRAF6的去泛素化功能減弱NF-κB信號系統(tǒng)的活性,從而發(fā)揮對天然免疫反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)作用。近年來,越來越多的研究證實A20與樹突狀細胞(Dendritic Cells,DCs)的激活、成熟及功能密切相關(guān)。因此,A20與免疫性疾病的研究也隨之增加。研究表明,缺乏A20的小鼠能夠自發(fā)性的激活樹突狀細胞及T淋巴細胞。A20fl/flCd11c-Cre小鼠能自發(fā)的形成血清陰性強直性關(guān)節(jié)炎、淋巴細胞性結(jié)腸炎和關(guān)節(jié)附著點炎。樹突狀細胞中A20基因的缺乏會增強細胞抗凋亡的能力,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。然而,除了A20基因相關(guān)多態(tài)性與眼部免疫性疾病有關(guān)外,就再無相關(guān)報道。因此,我們決定研究這種蛋白在葡萄膜炎患者及正常人血液中的表達水平。由于Behcet病和VKH綜合征是臨床中最常見和最容易引起失明的兩種葡萄膜炎類型,所有我們選擇這兩種疾病進行研究。為了闡明A20作用的可能機制,我們主要研究A20如何影響樹突狀細胞的功能情況。第一部分 A20在Behcet病與VKH綜合征患者中mRNA表達水平的研究目的A20在自身免疫中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,我們探討A20在Behcet病與VKH綜合征患者中mRNA的表達水平及與兩種疾病活動的相關(guān)性。方法選取活動期和靜止期Behcet病患者、VKH綜合征患者,同時選取性別和年齡相匹配的健康人作為對照組。Behcet病和VKH綜合征患者的診斷標準采用的是國際葡萄膜炎會議制定的診斷標準進行診斷。上述患者及健康人采用密度梯度離心分離外周血單核細胞,隨后,提取PBMCs中的總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測PBMCs中A20 mRNA的表達水平。結(jié)果1、活動期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達水平明顯低于靜止期Behcet病患者及正常人,而且活動期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達水平明顯降低。2、靜止期Behcet病患者及正常人的A20比較則無明顯的差異。3、活動期與靜止期VKH綜合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表達與正常人無明顯差異。結(jié)論我們的研究表明:活動期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達水平明顯低于靜止期Behcet病患者及正常人,而且活動期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達水平明顯降低。靜止期Behcet病患者及正常人的A20比較則無明顯的差異。以上結(jié)果說明A20的降低與Behcet病的發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系�；顒悠谂c靜止期VKH綜合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表達與正常人無明顯差異。以上結(jié)果說明A20的降低與VKH綜合征的發(fā)生沒有聯(lián)系。第二部分 A20在Behcet病患者DCs中mRNA表達水平的研究目的研究A20在Behcet病患者DCs中mRNA的表達水平情況及與疾病活動的相關(guān)性。方法選取活動期和靜止期Behcet病患者,同時選取性別和年齡相匹配的健康人作為對照組。上述患者及健康人采用密度梯度離心分離外周血單核細胞,通過磁珠分選的方法分離CD14~+T單核細胞,在培養(yǎng)基中加入人重組GM-CSF(100ng/ml)和人重組IL-4(50ng/ml)進行DCs誘導(dǎo)。最后,提取DCs總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測DCs中A20 mRNA的表達水平。結(jié)果1、活動期Behcet病患者DCs細胞中A20 mRNA的表達水平明顯低于正常人,統(tǒng)計有差異。2、活動期Behcet病患者和靜止期Behcet病患者相比,其DCs細胞中A20 mRNA表達水平降低,統(tǒng)計有差異。3、靜止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs細胞中A20 mRNA表達水平無明顯差異。結(jié)論活動期Behcet病患者DCs細胞中A20 mRNA表達水平明顯低于正常人�；顒悠贐ehcet病患者和靜止期Behcet病患者相比,其DCs細胞中A20 mRNA表達水平降低,而靜止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs細胞中A20 mRNA表達水平無明顯差異。這樣的結(jié)果與我們前面在PBMCs中的結(jié)果是一致的。那我們現(xiàn)在已經(jīng)明確知道,A20與DCs之間是有著緊密的聯(lián)系。第三部分 A20在DCs中的功能研究目的研究A20對Behcet病患者及健康人DCs成熟度及DCs分泌炎性細胞因子的影響情況。方法選取活動期和靜止期Behcet病患者,同時選取性別和年齡相匹配的健康人作為對照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細胞,并誘導(dǎo)成DCs。在誘導(dǎo)過程中,使用腺病毒按照不同的病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)轉(zhuǎn)染DCs。通過熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。選取合適的MOI值,使用腺病毒轉(zhuǎn)染DCs,采用流式細胞儀檢測DCs細胞表面的成熟標記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR,采用ELISA的方法檢測DCs細胞分泌炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表達情況。結(jié)果1、通過帶有GFP熒光基團標記的腺病毒轉(zhuǎn)染DCs,使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)MOI值為500時,綠色熒光蛋白的表達情況最高。2、當(dāng)MOI值為500時,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為78.7%。人A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染的DCs中A20呈現(xiàn)低表達。3、A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染DCs后,對DCs細胞表面的成熟標記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達水平?jīng)]有明顯的影響。4、通過腺病毒轉(zhuǎn)染的方法低表達A20,DCs細胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能夠負向調(diào)控DCs細胞分泌炎性因子的產(chǎn)生。結(jié)論腺病毒能夠有效的對DCs進行轉(zhuǎn)染,且轉(zhuǎn)染效率高。我們制備的人A20-shRNA腺病毒能夠阻斷A20的表達,并進行后續(xù)的研究。A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染DCs后,對DCs細胞表面的成熟標記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達水平?jīng)]有明顯的影響。說明A20并不是通過對DCs細胞成熟度的影響來發(fā)揮作用。通過腺病毒轉(zhuǎn)染的方法低表達A20,DCs細胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能夠負向調(diào)控DCs細胞分泌炎性因子的產(chǎn)生。說明A20在Behcet病發(fā)病機制中可能是通過影響DCs分泌的炎性細胞因子起作用。第四部分 A20對共培養(yǎng)體系中CD4+T細胞功能的影響目的研究A20通過DCs對CD4~+T細胞的影響。方法選取活動期Behcet病患者,同時選取性別和年齡相匹配的健康人作為對照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細胞,并誘導(dǎo)成DCs。在誘導(dǎo)過程中,使用腺病毒轉(zhuǎn)染DCs。LPS(100ng/ml)加入培養(yǎng)基中刺激24小時使其成為成熟的樹突狀細胞。再分離CD4~+T單核細胞,將DCs與CD4~+T細胞按照1:4共培養(yǎng),通過流式細胞技術(shù)檢測Th17細胞的比例。結(jié)果A20-shRNA組共培養(yǎng)的CD4~+T細胞中,Th17細胞所占CD4~+T細胞中的比例顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論A20-shRNA組共培養(yǎng)的CD4~+T細胞中,Th17細胞所占CD4~+T細胞中的比例顯著升高。這樣的結(jié)果也說明,Th17細胞與Behcet病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系,A20改變引起DCs活化和功能改變,最終引起Th17細胞改變,導(dǎo)致Behcet病的發(fā)生和發(fā)展。A20參與Behcet病發(fā)病機制的作用通路。第五部分 A20對DCs功能影響的機制目的A20是通過何種信號通路來影響DCs的功能還不得而知。本部分研究A20對DCs功能影響的機制。方法選取活動期和靜止期Behcet病患者,同時選取性別和年齡相匹配的健康人作為對照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細胞,并誘導(dǎo)成DCs。在DCs培養(yǎng)至第六天時,加入LPS(100ng/ml)刺激30分鐘,使用流式細胞技術(shù)檢測DCs中JNK、ERK1/2、P38的磷酸化水平。結(jié)果腺病毒轉(zhuǎn)染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明顯升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義,而ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有變化。結(jié)論腺病毒轉(zhuǎn)染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明顯升高,說明JNK及p38信號通路參與了A20對DCs的影響,A20可能通過JNK及p38信號通路影響DCs,導(dǎo)致Behcet病的發(fā)生和發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R773.9
【圖文】：

動期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A20 mRNA 的表達水平者及正常人，而且活動期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A2低，但能夠檢測的出來。而靜止期 Behcet 病患者及正差異（圖 1-1）。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文38圖1-2 活動期VKH綜合征患者、靜止期VKH綜合征患者和健康對照者PBMCs中A20 mRNA的表達水平情況Figure 1-2 Quantitative real time-PCR analysis ofA20 mRNAin PBMCs in active VKHpatients compared with inactive VKH patients and sex- and age-matched normal controlsindividuals3 討論葡萄膜炎是指影響葡萄膜（虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜）及其鄰近結(jié)構(gòu)（玻璃體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、血管）的任何一種炎癥過程。這種炎癥過程的起源可以是內(nèi)源性的，是全身性疾病的一部分或主要發(fā)生在眼部，也可以是外源性的，與任何一種影響眼球的感染因素相關(guān)，或者是發(fā)生于多系統(tǒng)感染。葡萄膜炎按照發(fā)生炎癥的解剖部位分類，可分為前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎 3種；按病因可將其分為感染性（細菌、病毒、真菌、寄生蟲等）和非感染性（特發(fā)性、自身免疫類、創(chuàng)傷性、偽裝綜合征等）兩大類。葡萄膜炎會嚴重威脅視力，如果不及時正確的處理，可能導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的視力喪失。多達 35%的葡萄膜炎患者至少有一只眼出現(xiàn)失明或視力損害[29]。在發(fā)達國家中，葡萄膜炎是第五位引起嚴重視力喪失的疾病，多達 20%的法定盲是由于葡萄膜炎的并發(fā)癥所引起[30]。其中 VKH 綜合征和 Behcet 病是亞洲常見的兩種葡萄膜炎疾病類型[31; 32]

ehcet 病患者 A20 的表達水平與正常人無中，我們已經(jīng)證實活動期 Behcet 病患者 PBMC于靜止期 Behcet 病患者及正常人。PBMCs 是外細胞、單核細胞、DCs 和其它少量細胞。其中 目前所知的功能最強的、唯一能激活初始性 T 胞(Antigen presenting cell, APC),是混合淋巴ion, MLR)中最強的刺激劑。DCs 已經(jīng)證實在Ⅰ型、SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病起重 DCs 中 A20 的表達情況。實驗結(jié)果顯示：活動 mRNA 表達水平明顯低于正常人�；顒悠� Behc比，其 DCs 細胞中 A20 mRNA 表達水平降低，相比，其 DCs 細胞中 A20 mRNA 表達水平無明

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊培增,張震,王紅,周紅顏,黃祥坤,李兵;葡萄膜炎的臨床類型及病因探討[J];中華眼底病雜志;2002年04期

2 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

本文編號：2794373