【摘要】：葡萄膜炎是眼部炎性疾病的一種類(lèi)型,視力喪失是其最常見(jiàn)的表現(xiàn)。在中國(guó),白塞氏病(Behcet disease,BD)和Vogt-小柳原田綜合征(Vogt Koyanagi Harada,VKH)是葡萄膜炎類(lèi)型中最常見(jiàn)的兩種疾病。Behcet病包括了血管炎性病變導(dǎo)致的葡萄膜炎、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍和生殖器潰瘍、多形性皮膚病變。VKH綜合征屬于自身免疫性疾病,最典型的特征是雙眼肉芽腫性葡萄膜炎,同時(shí)還常伴有腦膜刺激征、聽(tīng)力下降、耳鳴、皮膚和毛發(fā)異常等。葡萄膜炎的治療主要是應(yīng)用皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制藥物,但是臨床中發(fā)現(xiàn)使用上述藥物具有嚴(yán)重的副作用,因此,闡明葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更特異的藥物具有重要的意義。A20是在經(jīng)TNF-α處理后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中檢測(cè)到的一個(gè)誘導(dǎo)性表達(dá)蛋白,因此也被稱(chēng)為T(mén)NF-α誘導(dǎo)蛋白3(TNF-α-induced protein 3,TNFAIP3)。在我們團(tuán)隊(duì)的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A20基因中的rs9494885、rs10499194和rs7753873位點(diǎn)的多態(tài)性與Behcet病存在相關(guān),其中rs9494885與Behcet病存在強(qiáng)相關(guān);rs9494885位點(diǎn)的多態(tài)性與VKH綜合征存在密切相關(guān)。因此,我們將進(jìn)一步研究A20在Behcet病和VKH綜合征中的發(fā)病機(jī)制。A20表達(dá)于多個(gè)免疫器官,包括胸腺、脾臟和腸相關(guān)免疫組織等。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是TOLL樣受體信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子,其泛素化調(diào)節(jié)是NF-κB活化的關(guān)鍵因素,A20則通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)TRAF6的去泛素化功能減弱NF-κB信號(hào)系統(tǒng)的活性,從而發(fā)揮對(duì)天然免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。近年來(lái),越來(lái)越多的研究證實(shí)A20與樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs)的激活、成熟及功能密切相關(guān)。因此,A20與免疫性疾病的研究也隨之增加。研究表明,缺乏A20的小鼠能夠自發(fā)性的激活樹(shù)突狀細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞。A20fl/flCd11c-Cre小鼠能自發(fā)的形成血清陰性強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎和關(guān)節(jié)附著點(diǎn)炎。樹(shù)突狀細(xì)胞中A20基因的缺乏會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡的能力,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。然而,除了A20基因相關(guān)多態(tài)性與眼部免疫性疾病有關(guān)外,就再無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此,我們決定研究這種蛋白在葡萄膜炎患者及正常人血液中的表達(dá)水平。由于Behcet病和VKH綜合征是臨床中最常見(jiàn)和最容易引起失明的兩種葡萄膜炎類(lèi)型,所有我們選擇這兩種疾病進(jìn)行研究。為了闡明A20作用的可能機(jī)制,我們主要研究A20如何影響樹(shù)突狀細(xì)胞的功能情況。第一部分 A20在Behcet病與VKH綜合征患者中mRNA表達(dá)水平的研究目的A20在自身免疫中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,我們探討A20在Behcet病與VKH綜合征患者中mRNA的表達(dá)水平及與兩種疾病活動(dòng)的相關(guān)性。方法選取活動(dòng)期和靜止期Behcet病患者、VKH綜合征患者,同時(shí)選取性別和年齡相匹配的健康人作為對(duì)照組。Behcet病和VKH綜合征患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用的是國(guó)際葡萄膜炎會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。上述患者及健康人采用密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞,隨后,提取PBMCs中的總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果1、活動(dòng)期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平明顯低于靜止期Behcet病患者及正常人,而且活動(dòng)期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平明顯降低。2、靜止期Behcet病患者及正常人的A20比較則無(wú)明顯的差異。3、活動(dòng)期與靜止期VKH綜合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。結(jié)論我們的研究表明:活動(dòng)期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平明顯低于靜止期Behcet病患者及正常人,而且活動(dòng)期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平明顯降低。靜止期Behcet病患者及正常人的A20比較則無(wú)明顯的差異。以上結(jié)果說(shuō)明A20的降低與Behcet病的發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系。活動(dòng)期與靜止期VKH綜合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明A20的降低與VKH綜合征的發(fā)生沒(méi)有聯(lián)系。第二部分 A20在Behcet病患者DCs中mRNA表達(dá)水平的研究目的研究A20在Behcet病患者DCs中mRNA的表達(dá)水平情況及與疾病活動(dòng)的相關(guān)性。方法選取活動(dòng)期和靜止期Behcet病患者,同時(shí)選取性別和年齡相匹配的健康人作為對(duì)照組。上述患者及健康人采用密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞,通過(guò)磁珠分選的方法分離CD14~+T單核細(xì)胞,在培養(yǎng)基中加入人重組GM-CSF(100ng/ml)和人重組IL-4(50ng/ml)進(jìn)行DCs誘導(dǎo)。最后,提取DCs總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)DCs中A20 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果1、活動(dòng)期Behcet病患者DCs細(xì)胞中A20 mRNA的表達(dá)水平明顯低于正常人,統(tǒng)計(jì)有差異。2、活動(dòng)期Behcet病患者和靜止期Behcet病患者相比,其DCs細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)水平降低,統(tǒng)計(jì)有差異。3、靜止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。結(jié)論活動(dòng)期Behcet病患者DCs細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常人�；顒�(dòng)期Behcet病患者和靜止期Behcet病患者相比,其DCs細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)水平降低,而靜止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這樣的結(jié)果與我們前面在PBMCs中的結(jié)果是一致的。那我們現(xiàn)在已經(jīng)明確知道,A20與DCs之間是有著緊密的聯(lián)系。第三部分 A20在DCs中的功能研究目的研究A20對(duì)Behcet病患者及健康人DCs成熟度及DCs分泌炎性細(xì)胞因子的影響情況。方法選取活動(dòng)期和靜止期Behcet病患者,同時(shí)選取性別和年齡相匹配的健康人作為對(duì)照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞,并誘導(dǎo)成DCs。在誘導(dǎo)過(guò)程中,使用腺病毒按照不同的病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)轉(zhuǎn)染DCs。通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。選取合適的MOI值,使用腺病毒轉(zhuǎn)染DCs,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs細(xì)胞表面的成熟標(biāo)記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR,采用ELISA的方法檢測(cè)DCs細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表達(dá)情況。結(jié)果1、通過(guò)帶有GFP熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺病毒轉(zhuǎn)染DCs,使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)MOI值為500時(shí),綠色熒光蛋白的表達(dá)情況最高。2、當(dāng)MOI值為500時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為78.7%。人A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染的DCs中A20呈現(xiàn)低表達(dá)。3、A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染DCs后,對(duì)DCs細(xì)胞表面的成熟標(biāo)記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響。4、通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法低表達(dá)A20,DCs細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能夠負(fù)向調(diào)控DCs細(xì)胞分泌炎性因子的產(chǎn)生。結(jié)論腺病毒能夠有效的對(duì)DCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染,且轉(zhuǎn)染效率高。我們制備的人A20-shRNA腺病毒能夠阻斷A20的表達(dá),并進(jìn)行后續(xù)的研究。A20-shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染DCs后,對(duì)DCs細(xì)胞表面的成熟標(biāo)記分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響。說(shuō)明A20并不是通過(guò)對(duì)DCs細(xì)胞成熟度的影響來(lái)發(fā)揮作用。通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法低表達(dá)A20,DCs細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能夠負(fù)向調(diào)控DCs細(xì)胞分泌炎性因子的產(chǎn)生。說(shuō)明A20在Behcet病發(fā)病機(jī)制中可能是通過(guò)影響DCs分泌的炎性細(xì)胞因子起作用。第四部分 A20對(duì)共培養(yǎng)體系中CD4+T細(xì)胞功能的影響目的研究A20通過(guò)DCs對(duì)CD4~+T細(xì)胞的影響。方法選取活動(dòng)期Behcet病患者,同時(shí)選取性別和年齡相匹配的健康人作為對(duì)照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞,并誘導(dǎo)成DCs。在誘導(dǎo)過(guò)程中,使用腺病毒轉(zhuǎn)染DCs。LPS(100ng/ml)加入培養(yǎng)基中刺激24小時(shí)使其成為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。再分離CD4~+T單核細(xì)胞,將DCs與CD4~+T細(xì)胞按照1:4共培養(yǎng),通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞的比例。結(jié)果A20-shRNA組共培養(yǎng)的CD4~+T細(xì)胞中,Th17細(xì)胞所占CD4~+T細(xì)胞中的比例顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論A20-shRNA組共培養(yǎng)的CD4~+T細(xì)胞中,Th17細(xì)胞所占CD4~+T細(xì)胞中的比例顯著升高。這樣的結(jié)果也說(shuō)明,Th17細(xì)胞與Behcet病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系,A20改變引起DCs活化和功能改變,最終引起Th17細(xì)胞改變,導(dǎo)致Behcet病的發(fā)生和發(fā)展。A20參與Behcet病發(fā)病機(jī)制的作用通路。第五部分 A20對(duì)DCs功能影響的機(jī)制目的A20是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)影響DCs的功能還不得而知。本部分研究A20對(duì)DCs功能影響的機(jī)制。方法選取活動(dòng)期和靜止期Behcet病患者,同時(shí)選取性別和年齡相匹配的健康人作為對(duì)照組。采用密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞,并誘導(dǎo)成DCs。在DCs培養(yǎng)至第六天時(shí),加入LPS(100ng/ml)刺激30分鐘,使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs中JNK、ERK1/2、P38的磷酸化水平。結(jié)果腺病毒轉(zhuǎn)染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有變化。結(jié)論腺病毒轉(zhuǎn)染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明顯升高,說(shuō)明JNK及p38信號(hào)通路參與了A20對(duì)DCs的影響,A20可能通過(guò)JNK及p38信號(hào)通路影響DCs,導(dǎo)致Behcet病的發(fā)生和發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R773.9
【圖文】：

動(dòng)期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A20 mRNA 的表達(dá)水平者及正常人，而且活動(dòng)期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A2低，但能夠檢測(cè)的出來(lái)。而靜止期 Behcet 病患者及正差異（圖 1-1）。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文38圖1-2 活動(dòng)期VKH綜合征患者、靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照者PBMCs中A20 mRNA的表達(dá)水平情況Figure 1-2 Quantitative real time-PCR analysis ofA20 mRNAin PBMCs in active VKHpatients compared with inactive VKH patients and sex- and age-matched normal controlsindividuals3 討論葡萄膜炎是指影響葡萄膜（虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜）及其鄰近結(jié)構(gòu)（玻璃體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、血管）的任何一種炎癥過(guò)程。這種炎癥過(guò)程的起源可以是內(nèi)源性的，是全身性疾病的一部分或主要發(fā)生在眼部，也可以是外源性的，與任何一種影響眼球的感染因素相關(guān)，或者是發(fā)生于多系統(tǒng)感染。葡萄膜炎按照發(fā)生炎癥的解剖部位分類(lèi)，可分為前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎 3種；按病因可將其分為感染性（細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等）和非感染性（特發(fā)性、自身免疫類(lèi)、創(chuàng)傷性、偽裝綜合征等）兩大類(lèi)。葡萄膜炎會(huì)嚴(yán)重威脅視力，如果不及時(shí)正確的處理，可能導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的視力喪失。多達(dá) 35%的葡萄膜炎患者至少有一只眼出現(xiàn)失明或視力損害[29]。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，葡萄膜炎是第五位引起嚴(yán)重視力喪失的疾病，多達(dá) 20%的法定盲是由于葡萄膜炎的并發(fā)癥所引起[30]。其中 VKH 綜合征和 Behcet 病是亞洲常見(jiàn)的兩種葡萄膜炎疾病類(lèi)型[31; 32]

ehcet 病患者 A20 的表達(dá)水平與正常人無(wú)中，我們已經(jīng)證實(shí)活動(dòng)期 Behcet 病患者 PBMC于靜止期 Behcet 病患者及正常人。PBMCs 是外細(xì)胞、單核細(xì)胞、DCs 和其它少量細(xì)胞。其中 目前所知的功能最強(qiáng)的、唯一能激活初始性 T 胞(Antigen presenting cell, APC),是混合淋巴ion, MLR)中最強(qiáng)的刺激劑。DCs 已經(jīng)證實(shí)在Ⅰ型、SLE、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病起重 DCs 中 A20 的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：活動(dòng) mRNA 表達(dá)水平明顯低于正常人。活動(dòng)期 Behc比，其 DCs 細(xì)胞中 A20 mRNA 表達(dá)水平降低，相比，其 DCs 細(xì)胞中 A20 mRNA 表達(dá)水平無(wú)明

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊培增,張震,王紅,周紅顏,黃祥坤,李兵;葡萄膜炎的臨床類(lèi)型及病因探討[J];中華眼底病雜志;2002年04期

2 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

本文編號(hào)：2794373