本文關(guān)鍵詞：ENU誘變小眼畸形小鼠模型的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙烷基亞硝基脲(Ethylnitrosourea, ENU)是一種人工合成的能導(dǎo)致多種生物體發(fā)生隨機(jī)、單堿基突變的化合物。ENU能不依賴于任何代謝過程,而通過烷化反應(yīng)將其乙烷基加入DNA堿基的部分基團(tuán),從而引起堿基配對錯誤,在較短時間內(nèi)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量隨機(jī)突變表型。采用ENU誘變手段,本實驗室得一種常染色體顯性小眼畸形小鼠,該突變小鼠表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)小眼畸形,且嚴(yán)重程度不一,該小鼠突變純合子表現(xiàn)為出生時無眼且很快死亡。本研究以該突變系小鼠為研究對象,從以下三個部分開展研究工作：1 ENU誘變獲得一例小眼小鼠通過ENU誘變,在G1代小鼠中篩查發(fā)現(xiàn)了小眼表型的小鼠, 將其中一例小眼畸形C57BL/6(B6)雄性小鼠與正常B6雌鼠合籠,獲得B6背景的雜合子小鼠,觀察并記錄100只后代中,其-中23只小鼠具有小眼表型。將B6背景雜合子小鼠與DBA(D2)小鼠配種獲得F1代小鼠,F1代小鼠回交B6得到N2代小鼠,記錄的561只N2代小鼠中有21只表現(xiàn)為小眼表型。2小眼突變基因的定位及鑒定為了定位該突變基因,將(B6-D2)F1突變雜合子小鼠回交B6獲得N2代小鼠,提取N2代小鼠的鼠尾DNA,利用微衛(wèi)星對突變小鼠的染色體進(jìn)行全基因組掃描。定位結(jié)果表明在44個樣品中突變基因與微衛(wèi)星D18mit124與D18mit184之間未發(fā)生一例交換,最終將突變基因定位于微衛(wèi)星D18mit124與D18mit184之間。通過對局部區(qū)域基因功能分析,初步判定RAX基因為本突變候選基因。設(shè)計擴(kuò)增針對RAX基因編碼區(qū)引物,對野生型及小眼小鼠DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收后進(jìn)行測序比對,結(jié)果顯示突變小鼠RAX基因編碼第559位堿處發(fā)生C到T的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致編碼區(qū)第187位密碼子CGA(編碼精氨酸)變?yōu)榻K止密碼子TGA,引起蛋白編碼提前終止。3 R187X無義突變對RAX蛋白功能影響分析RT-PCR擴(kuò)增野生型及突變純合子小鼠RAX基因,將其克隆到pMD19-T載體上,然后再亞克隆到pCMV-tag2B真核表達(dá)載體,分別命名為pCMV-tag2B-wRAX、 pCMV-tag2B-mRAX。用脂質(zhì)體2000將以上重組載體轉(zhuǎn)染于COS-7細(xì)胞,分別用于后續(xù)的間接免疫熒光、PI染色以及EMSA實驗。間接免疫熒光及PI染色結(jié)果顯示正常及突變RAX蛋白都定位于細(xì)胞核,故排除R187X突變對RAX蛋白核定位的影響。EMSA實驗結(jié)果顯示R187X無義突變影響RAX蛋白與相關(guān)DNA序列結(jié)合,從而導(dǎo)致小鼠小眼表型。
【關(guān)鍵詞】：ENU 小眼畸形 基因定位 RAX基因及蛋白 EMSA
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R771;R-332
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-25
• 第一章 ENU誘變及突變基因的定位和克隆10-14
• 1 ENU誘變的基本原理10-11
• 2 誘變及篩查的手段11-12
• 3 突變基因的定位及克隆12
• 4 國內(nèi)外ENU誘變研究進(jìn)展12-14
• 第二章 小眼畸形及其相關(guān)基因14-16
• 1、SOX2(sex determining region Y-box2)14
• 2、OTX2(orthodenticle homeobox2)14-15
• 3、PAX6(paird box6)15
• 4、RAX(retina and anterior neural fold homeobox)15-16
• 第三章 凝膠電泳遷移率實驗16-18
• 參考文獻(xiàn)(References)18-25
• 第二部分 實驗內(nèi)容25-58
• 第三章 ENU誘變獲得一例小眼畸形小鼠25-33
• 1 材料25-26
• 2 實驗方法26-27
• 3 結(jié)果27-28
• 4 討論28-29
• 參考文獻(xiàn)(References)29-33
• 第四章 小眼畸形突變基因的定位及鑒定33-39
• 1 材料33-34
• 2 實驗方法34-35
• 3 結(jié)果35-36
• 4 討論36-38
• 參考文獻(xiàn)(References)38-39
• 第五章 R187X無義突變對RAX蛋白功能影響分析39-58
• 1 材料39-41
• 2 方法41-52
• 3 結(jié)果52-56
• 4 討論56
• 參考文獻(xiàn)(References)56-58
• 致謝58-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄59-60

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本文編號：279378