【摘要】：目的探討低能量半導(dǎo)體激光(Low-level semiconductor laser or Low-level laser therapy,LLLT)對體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制,從細(xì)胞水平和分子水平上為闡明低能量激光療法促進(jìn)義眼座血管化并防治義眼座暴露的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為臨床上治療血管生成依賴性疾病提供新的思路。方法1.確定最佳的促體外細(xì)胞增殖的LLLT的照射方式:體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC細(xì)胞,在不同光照參數(shù)和照射方式的LLLT處理HUVEC,以CCK8法檢測HUVEC細(xì)胞活性,確定低能量激光療法發(fā)揮促進(jìn)體外細(xì)胞增殖作用最佳的照射參數(shù)和照射方式,其中激光參數(shù)的變量包括:單次照射劑量/能量密度(0.1-20.0J/cm~2)和照射功率密度(2.07、5.25、9.92、20.99和31.35mw/cm~2);照射方式變量包括:照射間隔時間(48h、24h、12h、8h和6h)照射累計(jì)次數(shù)不同(照射間隔時間為12小時,累計(jì)照射次數(shù)分別為2、4和6次;間隔時間24小時,累計(jì)照射6次)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均設(shè)立不給予激光照射處理的對照組,其他處理同照射組。2.LLLT采用單次照射劑量(分別為1.0、2.0、4.0J/cm~2),照射間隔時間為12小時,累計(jì)照射6次的照射方式對HUVEC進(jìn)行處理,并與無LLLT處理的對照組進(jìn)行比較。(1)以CCK8法和EdU細(xì)胞增殖法檢測LLLT對HUVEC增殖活力的影響;(2)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測LLLT對HUVEC遷移的影響;(3)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測對HUVEC管樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響;(4)Western blot法檢測HUVEC內(nèi)PI3K/Akt通路中主要信號分子PI3K、Akt蛋白磷酸化的表達(dá)水平的變化,細(xì)胞內(nèi)eNOS、HIF-1α和VEGFA蛋白表達(dá)水平;(5)ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGFA的含量變化情況;(6)用LY294002(2μM)預(yù)處理1h預(yù)處理并給與LLLT處理后檢測HUVEC增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成以及細(xì)胞內(nèi)eNOS、HIF-1α和VEGFA的表達(dá)水平變化情況。結(jié)果1.最佳照射方式的確定:(1)促HUVEC增殖最佳劑量為4.0 J/cm~2,單次照射不同劑量的LLLT對HUVEC增殖的影響結(jié)果顯示,單次照射需達(dá)到1.0 J/cm~2的激光劑量才能發(fā)揮促細(xì)胞增殖效應(yīng),在一定范圍內(nèi)加大單次照射劑量(1.0-4.0J/cm~2),可使LLLT促細(xì)胞增殖作用提高,繼續(xù)加大單次照射劑量,LLLT促細(xì)胞增殖作用減弱,甚至?xí)种萍?xì)胞的增殖(20.0 J/cm~2);(2)不同功率密度對LLLT誘導(dǎo)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,2.07-31.35mW/cm~2功率密度范圍內(nèi)的LLLT,均可促進(jìn)細(xì)胞增殖,且在單次照射劑量相同條件下,增加激光照射的功率密度,可提高LLLT的促細(xì)胞增殖作用;(3)最佳照射間隔時間為12h,在單次照射劑量相同、功率密度相同條件下的LLLT,改變照射間隔時間當(dāng)間隔時間為24h、12h和8h的LLLT可促進(jìn)HUVEC的增殖,其中間隔時間為12h的LLLT促細(xì)胞增殖效果最佳,且間隔時間過長(48h)促細(xì)胞增殖效果不明顯,間隔時間過短(6h)甚至?xí)种萍?xì)胞增殖,引起細(xì)胞凋亡。(4)最佳累計(jì)照射次數(shù)為6次,在單次照射劑量、功率密度恒定和照射間隔時間相同條件下,以累計(jì)照射次數(shù)為6次的照射方式促進(jìn)細(xì)胞增殖效果均優(yōu)于其他組,且累計(jì)照射次數(shù)相同條件下,照射間隔時間為12h的LLLT較間隔時間為24h相比,促細(xì)胞增殖作用明顯提高。根據(jù)以上結(jié)果分析確定LLLT發(fā)揮促進(jìn)體外細(xì)胞增殖作用最佳的照射方式為:單次照射劑量4.0J/cm~2,照射間隔時間為12h,累計(jì)照射6次。2.LLLT對HUVEC的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響:(1)CCK8實(shí)驗(yàn)和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LLLT處理后細(xì)胞活力顯著增加,且LLLT促細(xì)胞增殖作用具有劑量依賴性;(2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LLLT處理后細(xì)胞遷移能力顯著提高,LLLT促細(xì)胞遷移作用具有劑量依賴性,且隨著激光照射次數(shù)的增加,LLLT促細(xì)胞遷移作用增強(qiáng)。(3)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,單次照射劑量為2.0和4.0 J/cm~2的LLLT處理后較對照組比細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成能力顯著提高,并具有劑量依賴性。3.Western Blot和EILSA結(jié)果顯示:(1)使用LLLT處理后各組PI3K、Akt蛋白磷酸水平升高,eNOS、HIF-1α和VEGFA的表達(dá)水平升高,且蛋白磷酸化水平和蛋白的表達(dá)水平的變化與激光單次照射劑量存在依賴性;(2)LY294002預(yù)處理1h預(yù)處理給與LLLT處理后的HUVEC,與照射組相比較,LLLT促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移作用減弱,但對HUVEC管樣結(jié)構(gòu)的形成無明顯影響;LY294002預(yù)處理1h預(yù)處理后可減弱LLLT誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)eNOS、HIF-1α和VEGFA蛋白的表達(dá)水平的上調(diào)以及促進(jìn)VEGFA的分泌。結(jié)論1.LLLT通過PI3K信號通路依賴性方式上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、eNOS和VEGFA的表達(dá)水平和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。2.LLLT促血管內(nèi)皮細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成作用可能是通過激活細(xì)胞內(nèi)其他信號通路發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R779.64
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果1 低能量激光最佳照射方式.1 單次照射不同劑量對 HUVEC 增殖的影響在本實(shí)驗(yàn)中檢測了單次照射劑量不同條件下 LLLT 對 HUVEC 增殖的影驗(yàn)結(jié)果顯示：低能量激光療法對內(nèi)皮細(xì)胞有促增殖的作用，且其作用具有依賴性，在單次照射劑量過低的低能量激光療法對細(xì)胞增殖無影響（0.1J 0.5J/cm2）,與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），而過高的照則會產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用（20J/cm2），與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)p＜0.01）；在一定照射劑量范圍內(nèi)（1.0-4.0J/cm2），低能量激光療法促 HU殖的作用與照射劑量呈正相關(guān)，即照射劑量越大，促增殖效果越明顯。計(jì)分析，單次照射劑量為 4.0J/cm2的 LLLT 促細(xì)胞增殖效果最佳（圖 3-1

第 3 章 結(jié)果不同的照射間隔時間對 HUVEC 增殖的影響實(shí)驗(yàn)中檢測不同照射間隔時間的 LLLT 對 HUVEC 增殖的影響，：因照射間隔時間不同，LLLT 促 HUVEC 細(xì)胞增殖的效果不同，，照射間隔時間為 24h、12h 和 8h 的 LLLT 可促進(jìn) HUVEC 的增計(jì)學(xué)意義（均 p＜0.05），照射間隔時間為 6h 的照射組抑制了 HU與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；可有效促進(jìn) HU射組之間兩兩對比，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析照射間隔時間為 12 小時的 LC 增殖的作用最佳（圖 3-2）。

3 CCK8 法檢測不同的激光功率密度對 HUVEC 增殖影響分析結(jié)果。以均值±標(biāo)組吸光度值的柱狀圖，（*p＜0.05.vs control）。同時，我們還對后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用的不同功率密度條件下，觀察單次照 1.0、2.0 和 4.0 J/cm2的 LLLT 對 HUVEC 增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：率密度相同條件下，提高單次照射劑量可提高 LLLT 促細(xì)胞增殖作用

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本文編號：2779455