【摘要】：縫隙連接蛋白的缺陷能引起縫隙連接通道功能障礙,從而導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病。所有縫隙連接蛋白中,縫隙連接蛋白26(Connexin26,Cx26)最為著名,發(fā)病率也最高。在幾乎所有人種中,都發(fā)現(xiàn)了 Cx26缺陷相關(guān)的非綜合征性或綜合征性耳聾。Cx26缺陷常常會嚴(yán)重影響耳蝸功能導(dǎo)致耳聾。Cx26由GJB2基因編碼,東亞人最高發(fā)的缺陷類型是235delC,其攜帶率約為1%。目前Cx26缺陷的致聾機制還未完全闡明,動物和人的研究存在差異,如在小鼠模型的研究中,完全敲除Cx26表達(dá)會阻礙跨胎盤的葡萄糖攝取,導(dǎo)致胚胎死亡。而人Cx26缺陷一般不會引起人胚胎的致死性事件,原因是人體胎盤屏障的結(jié)構(gòu)與小鼠有很大的不同,Cx26缺陷不會影響人胚胎跨胎盤的葡萄糖攝取。但在聽覺發(fā)育中,Cx26功能的重要性顯然強于在胎盤中,Cx26缺陷常常造成聽覺發(fā)育的異常,最終導(dǎo)致耳聾。2006 年 Takahashi 和 Yamanaka 發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控體細(xì)胞的 Oct4,Sox2,Klf4,c-myc 這 4個基因可以將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。中國學(xué)者隨后證明了該細(xì)胞的全能性。iPSC像胚胎干細(xì)胞等其他多能干細(xì)胞一樣,經(jīng)過生長因子和細(xì)胞傳代條件的調(diào)節(jié),可以分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。iPSC分化出的神經(jīng)元細(xì)胞帶有特定病人的基因信息,即帶有特定的基因突變或神經(jīng)疾病。在這樣的條件下,我們能通過研究人的iPSC來研究特定人體的活體神經(jīng)組織。近年的研究發(fā)現(xiàn)了數(shù)個可作為iPSC來源的簡易途徑,包括皮膚成纖維細(xì)胞、外周血細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞。iPSC技術(shù)的發(fā)明為人體疾病模型的建立、疾病細(xì)胞的研究和治療提供了廣闊的前景。本論文開展了如下三個方面的研究:1.采用非整合Episomal質(zhì)粒誘導(dǎo)方式,重編程Cx26缺陷耳聾患者的體細(xì)胞,建立疾病特異的iPSC細(xì)胞系的初步研究。結(jié)果顯示:患者的耳后皮膚組織切塊,并原代培養(yǎng)后,于第7天,人皮膚組織周圍可以觀察到大量類成纖維細(xì)胞增生。將成纖維細(xì)胞擴增后,以非整合Episomal質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染,電轉(zhuǎn)染第7天能明顯觀察到細(xì)胞的形態(tài)由原先的梭形慢慢變圓,電轉(zhuǎn)染患者成纖維細(xì)胞2周后,可以觀察到一些形態(tài)類似于hESC的單克隆群落。所有患者來源細(xì)胞的培養(yǎng)中都可以收集到堿性磷酸酶陽性的類hESC單克隆群落。PCR排除了載體自身基因oriP/EBNA1整合入這些克隆的可能。傳代數(shù)次后,分別得到了所有3個患者特異的iPSC系,依序分別命名為iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3。DNA測序確認(rèn)了這3個細(xì)胞系中Cx26 GJB2 235delC突變。免疫熒光確認(rèn)了這3個細(xì)胞系都表達(dá)人胚胎多能性干細(xì)胞核蛋白OCT4 and膜蛋白SSEA4,而未檢測到小鼠多能性干細(xì)胞特異性膜蛋白SSEA-1的表達(dá)。RT-PCR顯示內(nèi)源性O(shè)CT4,SOX2,NANOG,DPPA3的表達(dá)和H9 hESC基本一致。核型分析顯示這些細(xì)胞系有正常的46條染色體。所有這些數(shù)據(jù)顯示這些Cx26缺陷的iPSC系來源于人皮膚成纖維細(xì)胞,同時擁有多能干細(xì)胞的特征。2.評價Cx26缺陷iPSC細(xì)胞系向各胚層分化的體內(nèi)、體外研究。為了評價Cx26缺陷iPSC細(xì)胞系的體外分化能力,將iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3繼續(xù)培養(yǎng)7天后分化為擬胚體(embryoid bodies,EBs)。實時PCR顯示EBs表達(dá)所有三個胚層的關(guān)鍵標(biāo)記物,包括外胚層的microtubule-associated protein 2(MAP2),paired box 6(PAX6),中胚層的Msh homeobox1(MSX1)和內(nèi)胚層的 SRY-box containing gene 17(SOX17)(Fig.S2B)。為了評價體內(nèi)分化能力,將iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3各1X106細(xì)胞分別注入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency,SCID)。4周后,可以從皮下得到各個細(xì)胞系形成的畸胎瘤。HE(hematoxylin-eosin)染色后,光鏡下可以見到三胚層組織,包括內(nèi)胚層的腺體結(jié)構(gòu)、中胚層的軟骨和外胚層的上皮、神經(jīng)纖維。這些結(jié)果顯示這三個系具有多能干細(xì)胞的體內(nèi)體外分化能力。3.Cx26缺陷iPSC細(xì)胞系向神經(jīng)細(xì)胞分化、建立疾病細(xì)胞模型、及其基因表達(dá)差異的研究。去除飼養(yǎng)細(xì)胞和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)后,3個iPSC系很快分化為EB。7天后EB進(jìn)一步分化出神經(jīng)上皮(neuroepithelial,NE),12-18天可以發(fā)現(xiàn)典型的神經(jīng)管狀花結(jié)。NE中高度表達(dá)PAX6和N-CADHERIN,并且在神經(jīng)管形成后進(jìn)一步上調(diào),同時多能性基因NANOG在分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cells,NPCs)后顯著下調(diào)。在神經(jīng)分化過程中,具有典型柱狀上皮形態(tài)的神經(jīng)上皮細(xì)胞逐漸出現(xiàn),第10天,免疫熒光可以染出強陽性的神經(jīng)外胚層轉(zhuǎn)錄因子PAX6和NESTIN。神經(jīng)球培養(yǎng)數(shù)天,可觀察到突觸樣結(jié)構(gòu)形成,向神經(jīng)元分化。第20天,可以觀察到NEUN、class Ⅲ β-tubulin(TUBB3)染色弱陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞。第42天,可觀察到一些形態(tài)類似星形膠質(zhì)細(xì)胞、高表達(dá)GFAP的細(xì)胞團。同期在其他細(xì)胞中可以觀察到典型的神經(jīng)元突觸樣結(jié)構(gòu),TUBB3染色強陽性。所有Cx26缺陷iPSC來源的神經(jīng)細(xì)胞,和作為對照的hESC來源神經(jīng)細(xì)胞沒有觀察到形態(tài)上的區(qū)別。以上結(jié)果顯示,所有3個Cx26缺陷iPSC能夠和hESC一樣在體外分化為相似的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞,形態(tài)、內(nèi)源性、外源性基因表達(dá)都非常一致。iPSC和hESC來源的神經(jīng)元細(xì)胞中,Q-PCR檢測縫隙連接蛋白基因GJB1(Cx32)、GJB2(Cx26)、GJD2(Cx36)表達(dá)水平,結(jié)果顯示,所有iPSC來源神經(jīng)元細(xì)胞與hESC來源神經(jīng)元細(xì)胞比較,Cx26(GJB2)變化不顯著,Cx32(GJB1)表達(dá)明顯上調(diào),Cx36(GJD2)表達(dá)略微上調(diào)。結(jié)論:能夠成功通過非整合Episomal載體轉(zhuǎn)染建立Cx26缺陷聾的iPSC細(xì)胞系,Cx26缺陷不影響細(xì)胞系的神經(jīng)分化,在Cx26缺陷聾的神經(jīng)細(xì)胞模型中,Cx32可能發(fā)揮代償作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R764.43
【圖文】：

２．４實驗結(jié)果逡逑２．４．１人皮膚原代成纖維細(xì)胞的獲得逡逑人皮膚原代培養(yǎng)一周后，可觀察到大量長條梭形細(xì)胞增生，（圖２－１）。逡逑圖２－１培養(yǎng)一周時原代人成纖}赴義希疲椋紓玻卞澹裕瑁邋澹悖澹歟戾澹恚錚潁穡瑁錚歟錚紓澹錚駑澹穡潁椋恚椋簦椋觶邋澹悖酰歟簦酰潁邋澹簦镥澹簦瑁邋澹瑁酰恚幔鑠澹媯椋猓潁錚猓歟幔螅翦澹悖澹歟歟簀澹錚睿邋澹鰨澹澹脲義希玻村義

本文編號：2776064