【摘要】：第一部分FOXO3a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響目的:檢測(cè)沉默F(xiàn)OXO3a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響。方法:Western blotting實(shí)驗(yàn)和q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種鼻咽癌細(xì)胞系(CNE1,CNE2,HNE1,和CNE1-LMP1)中FOXO3a的基礎(chǔ)表達(dá)量。Western blotting實(shí)驗(yàn)和Real-time polymerase chain reaction(q RT-PCR)檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)6Gy射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)FOXO3a的表達(dá)情況。四種慢病毒Mock sh RNA、FOXO3a sh RNA1、FOXO3a sh RNA2和FOXO3a sh RNA3分別轉(zhuǎn)染CNE2和HNE1,使用western blotting和q RT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默F(xiàn)OXO3a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響。western blotting實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)與定位。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默F(xiàn)OXO3a對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:各鼻咽癌細(xì)胞系中FOXO3a蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)量無(wú)明顯差異。Western blotting實(shí)驗(yàn)和q RT-PCR證實(shí)經(jīng)過(guò)6Gy射線照射后鼻咽癌細(xì)胞系中FOXO3a表達(dá)量明顯減少,24h減少量達(dá)到最高峰。我們對(duì)CNE2和HNE1進(jìn)行了慢病毒轉(zhuǎn)染,western blotting實(shí)和q RT-PCR顯示FOXO3a sh RNA3的轉(zhuǎn)染效率最佳。于是我們選擇轉(zhuǎn)染了FOXO3a sh RNA3(CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3)和Mock sh RNA(CNE2-Mock、HNE1-Mock)的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量照射條件下的,CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相較CNE2-Mock、HNE1-Mock克隆數(shù)明顯增多,說(shuō)明沉默F(xiàn)OXO3a可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生放射抵抗。應(yīng)用western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相較CNE2-Mock、HNE1-Mock上皮相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)量明顯減少,而間質(zhì)相關(guān)蛋白vimentin、N-cadherin表達(dá)量明顯增多。同時(shí)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相較CNE2-Mock、HNE1-Mock定位于細(xì)胞膜上的蛋白E-cadherin熒光強(qiáng)度明顯減弱,而定位于胞漿的vimentin熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)證明沉默F(xiàn)OXO3a可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)沉默F(xiàn)OXO3a可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:沉默F(xiàn)OXO3a可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生放射抵抗,其放射敏感性明顯降低。沉默F(xiàn)OXO3a上皮相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)量明顯減少,而間質(zhì)相關(guān)蛋白vimentin、N-cadherin表達(dá)量明顯增多,誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT,可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。第二部分沉默F(xiàn)OXO3a誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的作用機(jī)制研究目的:研究FOXO3a調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的作用機(jī)制。方法:Western blotting實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)過(guò)6Gy的射線照射后E-cadherin和β-catenin的表達(dá)情況。應(yīng)用western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了在射線照射下各組鼻咽癌細(xì)胞在48h和72h的凋亡情況。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了在射線照射下各組鼻咽癌細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞周期的分布情況。將FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染,并進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了共轉(zhuǎn)染FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA后Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。Western blotting實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了共轉(zhuǎn)染FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)6Gy的射線照射后,總蛋白中E-cadherin的表達(dá)減少,同時(shí)核蛋白β-catenin的表達(dá)也明顯增多。當(dāng)FOXO3a被沉默后,其總蛋白E-cadherin表達(dá)減少更明顯,細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin表達(dá)也明顯升高。免疫熒光實(shí)驗(yàn)與western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXO3a后,β-catenin的下游基因c-Myc和cyclin D1的含量升高,激活Wnt/β-catenin通路。流式細(xì)胞術(shù)顯示沉默F(xiàn)OXO3a可抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡以及G2/M期阻滯。我們將FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染,并進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)FOXO3a sh RNA相比Control sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)明顯增多,β-catenin sh RNA相比Control sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)明顯減少,FOXO3a sh RNA+β-catenin sh RNA相比FOXO3a sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)減少。而沉默β-catenin可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXO3a導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的激活,卻對(duì)FOXO3a的表達(dá)無(wú)明顯影響。沉默β-catenin也可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXO3a導(dǎo)致的EMT。結(jié)論:沉默F(xiàn)OXO3a可促進(jìn)β-catenin入核,使β-catenin的表達(dá)明顯增多,進(jìn)而上調(diào)其下游靶基因c-Myc和cyclin D1,激活Wnt/β-catenin通路,然后抑制鼻咽癌細(xì)胞的凋亡和G2/M期阻滯進(jìn)而誘導(dǎo)鼻咽癌產(chǎn)生獲得性放射抵抗的。沉默β-catenin可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXO3a導(dǎo)致的β-catenin下游靶基因活化,但是對(duì)FOXO3a的表達(dá)無(wú)影響,說(shuō)明沉默F(xiàn)OXO3a可單向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路進(jìn)而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生放射抵抗。沉默β-catenin也可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXO3a導(dǎo)致的EMT,但是Wnt/β-catenin通路與EMT的具體調(diào)控機(jī)制仍舊需要進(jìn)一步的研究。第三部分沉默F(xiàn)OXO3a誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的體內(nèi)研究目的:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討FOXO3a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響。方法:建立裸鼠移植瘤模型,隨機(jī)分組,分別為鼻咽癌細(xì)胞FOXO3a沉默組、空載組、鼻咽癌細(xì)胞FOXO3a沉默放療組與空載放療組。照射組給予8Gy射線照射,記錄移植瘤出瘤時(shí)間,腫瘤體積,28天后處死裸鼠,取移植瘤拍照稱重。免疫組化和western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:4組裸鼠全部成瘤,CNE2-sh RNA3組和CNE2-sh RNA3 IR組成瘤時(shí)間平均為4天,CNE2-Mock組和CNE2-Mock IR組成瘤時(shí)間平均為6天。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到50mm3時(shí),給予放療組裸鼠局部10Gy射線照射.照射組較非照射組移植瘤的體積明顯縮小,生長(zhǎng)速度減緩。而沉默F(xiàn)OXO3a可使移植瘤生長(zhǎng)迅速,體積較對(duì)照組明顯增大。28天后處死裸鼠,取移植瘤拍照稱重。照射組較非照射組移植瘤的重量明顯減輕,沉默F(xiàn)OXO3a可使移植瘤重量較對(duì)照組明顯增加。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CNE2-sh RNA3組對(duì)比CNE2-Mock組,FOXO3a的表達(dá)明顯減少,E-cadherin的表達(dá)缺失,N-cadherin和vimentin的表達(dá)增多,說(shuō)明沉默F(xiàn)OXO3a可在體內(nèi)水平誘導(dǎo)EMT.同時(shí)CNE2-sh RNA3組對(duì)比CNE2-Mock組,β-catenin以及其下游的c-Myc、cyclin D1表達(dá)增多,GSk-3β表達(dá)減少,說(shuō)明沉默F(xiàn)OXO3a可在體內(nèi)水平激活Wnt/β-catenin通路。western blotting實(shí)驗(yàn)與免疫組化結(jié)果一致。沉默F(xiàn)OXO3a組相比對(duì)照組ki-67的表達(dá)明顯增加,同時(shí)可抑制凋亡的發(fā)生。沉默F(xiàn)OXO3a后,移植瘤生長(zhǎng)速度增快,可在體內(nèi)水平誘導(dǎo)EMT和激活Wnt/β-catenin通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,使移植瘤出現(xiàn)放射抵抗。結(jié)論:沉默F(xiàn)OXO3a可在動(dòng)物水平誘導(dǎo)鼻咽癌放射抵抗。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.63
【圖文】：

1.1 鼻咽癌細(xì)胞系中 FOXO3a 的表達(dá)情況（A、Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各鼻咽癌細(xì)胞系XO3a 的蛋白表達(dá)。B、根據(jù) FOXO3a 蛋白的灰度值繪制的柱狀圖。C、 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞系中 FOXO3a mRNA 的基礎(chǔ)表達(dá)量。*代表 P<0.05，**代表 P<0.01，* **代表 P<0.00. 檢測(cè)射線對(duì) FOXO3a 的表達(dá)的影響我們檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞系經(jīng)過(guò) 6Gy 射線照射后不同時(shí)間點(diǎn) FOXO3a 的表達(dá)情況estern blotting 實(shí)驗(yàn)證實(shí)各經(jīng)過(guò) 6Gy 射線照射后鼻咽癌細(xì)胞系中 FOXO3a 蛋白的表達(dá)明顯減少，24h 減少量達(dá)到最高峰，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.2A、B）。qRT-PC驗(yàn)證實(shí)各經(jīng)過(guò)6Gy射線照射后鼻咽癌細(xì)胞系中FOXO3a mRNA的表達(dá)量明顯減少4h 減少量達(dá)到最高峰，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.2 C）。證實(shí)射線照射與鼻咽癌細(xì)系中 FOXO3a 的表達(dá)量具有密切關(guān)系。

1.2 射線對(duì) FOXO3a 的表達(dá)的影響（A、Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各經(jīng)過(guò) 6Gy 射線照射后鼻咽胞系中 FOXO3a 蛋白的表達(dá)量。 B、根據(jù) FOXO3a 蛋白的灰度值繪制的柱狀圖。C、qRT-PCR檢測(cè)經(jīng)過(guò) 6Gy 射線照射后鼻咽癌細(xì)胞系中 FOXO3a mRNA 的表達(dá)量。*代表 P<0.05， **代P<0.01，* **代表 P<0.001 ）檢測(cè)沉默 FOXO3a 的轉(zhuǎn)染效率為了進(jìn)行下一步研究，我們對(duì)CNE2和HNE1進(jìn)行了慢病毒轉(zhuǎn)染。用四種慢病毒ck shRNA、FOXO3a shRNA1、FOXO3a shRNA2 和 FOXO3a shRNA3分別轉(zhuǎn)染E2和HNE1, 使用western blotting和qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。Western blotting實(shí)驗(yàn)示，轉(zhuǎn)染了FOXO3a shRNA的鼻咽癌細(xì)胞相對(duì)轉(zhuǎn)染了Mock shRNA的鼻咽癌細(xì)胞可顯抑制FOXO3a的蛋白表達(dá)，其中shRNA3的轉(zhuǎn)染效率最佳（圖1.3A、B）。qRT-PCR示轉(zhuǎn)染了FOXO3a shRNA的鼻咽癌細(xì)胞相對(duì)轉(zhuǎn)染了Mock shRNA的鼻咽癌細(xì)胞可明抑制FOXO3a的mRNA表達(dá)，抑制效率都>70%, 其中shRNA3的轉(zhuǎn)染效率最佳（圖1.3。于是我們選擇轉(zhuǎn)染了FOXO3a shRNA3（CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA3） 和

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文33圖1.3 檢測(cè)沉默F(xiàn)OXO3a的轉(zhuǎn)染效率（A、western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。B、根據(jù)FOXO3a蛋白的灰度值繪制的柱狀圖。C、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。*代表P<0.05， **代表P<0.01，* **代表P<0.001）4. 沉默 FOXO3a 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響我們應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默F(xiàn)OXO3a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響。我們發(fā)現(xiàn)在不同劑量照射條件下的，CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA3相較CNE2-Mock、HNE1-Mock克隆數(shù)明顯增多（圖1.4 A）。 同時(shí)我們應(yīng)用GraphPad Prism5.0 軟件應(yīng)用單機(jī)多靶模型繪制其擬合曲線，比較兩組細(xì)胞放射敏感性差異以及相應(yīng)放射生物學(xué)參數(shù)（圖1.4 C）。CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA存活分?jǐn)?shù)（SF2）、平均致死劑量（D0）和準(zhǔn)域劑量（Dq）等放射生物學(xué)參數(shù)均顯著高于CNE2-Mock、HNE1-Mock（見(jiàn)表1），（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此部分實(shí)驗(yàn)說(shuō)明沉默F(xiàn)OXO3a可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生放射抵抗，其放射敏感性明顯降低。ABC

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772241