【摘要】：目的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是最常見的兒童眼內(nèi)腫瘤,其治療效果差、致死率高,嚴(yán)重威脅患兒的視力甚至生命。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等的復(fù)雜的生物學(xué)過程,并由很多的信號(hào)通路參與。因此,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移以及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡對(duì)于控制腫瘤的發(fā)展具有重要的意義。MicroRNA是一類廣泛存在的,長約19-25個(gè)核苷酸大小的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,通過特異性抑制或者降解靶mRNA的翻譯從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。通過靶基因參與細(xì)胞一系列生命活動(dòng)的調(diào)控,如細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡等功能。研究表明miR-22在多種腫瘤中異常表達(dá),通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖或凋亡,直接影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)miR-22在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中低表達(dá),但其具體生物學(xué)功能及機(jī)制尚不清楚。在本論文中,我們研究了miR-22對(duì)Y79細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并闡述其可能的作用機(jī)制,為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供新的思路和理論依據(jù)。方法1.轉(zhuǎn)染miR-22過表達(dá)真核質(zhì)粒上調(diào)miR-22的表達(dá),將細(xì)胞分為正常組(N)、陰性對(duì)照組(GV251)、過表達(dá)miR-22組(GV251/miR-22)。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的遷移率,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。2.利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)以上各組細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3.轉(zhuǎn)染miR-22shRNA真核質(zhì)粒,RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞miR-22的表達(dá)。將細(xì)胞分為正常組(N)、陰性對(duì)照組(GV249)、低表達(dá)miR-22組(GV249/miR-22-siRNA),利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)以上各組細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。4.轉(zhuǎn)染HMGB1shRNA真核質(zhì)粒,利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。將細(xì)胞分為正常組(N)、陰性對(duì)照組(GV102)、低表達(dá)HMGB1組(GV102/HMGB1-siRNA)。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。5.轉(zhuǎn)染過表達(dá)HMGB1真核質(zhì)粒,利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1,將細(xì)胞分為N,GV251/miR-22,GV251/miR-22+GV230,GV251/miR-22+GV230/HMGB1四組,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。6.Y79細(xì)胞分為N,GV251/miR-22,GV102/HMGB1-siRNA,GV230/HMGB1,GV251/miR-22+GV230/HMGB1五組,Western blot觀察各組細(xì)胞AKT和p-AKT的表達(dá)。結(jié)果1.轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-22真核質(zhì)粒明顯上調(diào)miR-22的表達(dá)(P0.05)。與陰性對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-22組細(xì)胞的增殖減低,遷移率降低,細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞的凋亡率增加。提示上調(diào)miR-22抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。2.與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-22組細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。3.轉(zhuǎn)染miR-22shRNA真核質(zhì)粒明顯降低miR-22的表達(dá)(P0.05)。與對(duì)照組相比,低表達(dá)miR-22組細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加。4.轉(zhuǎn)染HMGB1shRNA真核質(zhì)粒,明顯降低細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。與陰性對(duì)照組相比,低表達(dá)HMGB1組細(xì)胞的增殖減低,遷移率降低,細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞的凋亡率增加。提示敲低HMGB1的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。5.轉(zhuǎn)染過表達(dá)HMGB1真核質(zhì)粒,明顯提高細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。與GV251/miR-22+GV230組相比,共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1組細(xì)胞的增殖和遷移力增強(qiáng)、侵襲的細(xì)胞數(shù)增多、細(xì)胞的凋亡率減低。提示共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-22對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。6.Western blot結(jié)果顯示GV251/miR-22和GV102/HMGB1-siRNA組AKT的磷酸化水平較正常組明顯減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。GV230/HMGB1組AKT的磷酸化水平較正常組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。共轉(zhuǎn)染組AKT磷酸化水平較GV251/miR-22組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論上調(diào)miR-22顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。miR-22在Y79細(xì)胞中負(fù)向調(diào)節(jié)HMGB1的表達(dá),miR-22通過HMGB1發(fā)揮抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的作用。PI3K/AKT通路參與miR-22/HMGB1對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.7
【圖文】：

B圖 1-1 GV251/miR-22 重組質(zhì)粒 PCR 及基因測(cè)序鑒定結(jié)果。(A) GV251/miR-22 重組質(zhì)粒PCR 結(jié)果。(B) GV251/miR-22 重組質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果。Fig1-1 PCR and gene sequencing results of miR-22 overexpression recombinant plasmid. (A)PCR result of GV251/miR-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing result of GV251/miR-22recombinant plasmid．2.2 轉(zhuǎn)染 GV251/miR-22 對(duì) miR-22 表達(dá)水平的影響為了研究 miR-22 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中具體的生物學(xué)功能，我們?cè)谏虾＜獎(jiǎng)P基因公司構(gòu)建成功 miR-22 過表達(dá)重組質(zhì)粒 GV251/miR-22，轉(zhuǎn)染 Y79 細(xì)胞上調(diào)miR-22 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分為 GV251/miR-22，GV251，N 三組，U6 作為內(nèi)參，用 RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞 miR-22 的表達(dá)水平。如圖 1-2 所示，GV251/miR-22

iR-22 重組質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果。quencing results of miR-22 overexpression re-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing -22 對(duì) miR-22 表達(dá)水平的影響 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中具體的生物學(xué)功能iR-22 過表達(dá)重組質(zhì)粒 GV251/miR-22，實(shí)驗(yàn)分為 GV251/miR-22，GV251，N 三細(xì)胞 miR-22 的表達(dá)水平。如圖 1-2 所調(diào) miR-22 水平（約 1 倍），差異有統(tǒng)

quantitative PCR detected the effect of miR-22 oveession level of miR-22. U6 is set as an internal 1 group.細(xì)胞增殖的影響CK-8 實(shí)驗(yàn)觀察上調(diào) miR-22 對(duì)細(xì)胞增殖的251,N 三組，轉(zhuǎn)染 GV251/miR-22 后 0h，6殖的影響。6h GV251/miR-22 組較 GV2512h，24h，48h GV251/miR-22 組較 GV251 組統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。也就是說，上調(diào) miR2 組較 GV251 組顯著抑制細(xì)胞的增殖。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2770459