【摘要】：目的視網(wǎng)膜母細胞瘤是最常見的兒童眼內(nèi)腫瘤,其治療效果差、致死率高,嚴重威脅患兒的視力甚至生命。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等的復(fù)雜的生物學(xué)過程,并由很多的信號通路參與。因此,抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移以及促進細胞的凋亡對于控制腫瘤的發(fā)展具有重要的意義。MicroRNA是一類廣泛存在的,長約19-25個核苷酸大小的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,通過特異性抑制或者降解靶mRNA的翻譯從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。通過靶基因參與細胞一系列生命活動的調(diào)控,如細胞周期、細胞分化、細胞增殖和凋亡等功能。研究表明miR-22在多種腫瘤中異常表達,通過調(diào)節(jié)細胞的增殖或凋亡,直接影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)miR-22在視網(wǎng)膜母細胞瘤中低表達,但其具體生物學(xué)功能及機制尚不清楚。在本論文中,我們研究了miR-22對Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并闡述其可能的作用機制,為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療提供新的思路和理論依據(jù)。方法1.轉(zhuǎn)染miR-22過表達真核質(zhì)粒上調(diào)miR-22的表達,將細胞分為正常組(N)、陰性對照組(GV251)、過表達miR-22組(GV251/miR-22)。CCK-8法檢測各組細胞的增殖,細胞劃痕實驗觀察各組細胞的遷移率,Transwell實驗觀察各組細胞侵襲的細胞數(shù),流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。2.利用RT-qPCR和Western blot檢測以上各組細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。3.轉(zhuǎn)染miR-22shRNA真核質(zhì)粒,RT-qPCR檢測細胞miR-22的表達。將細胞分為正常組(N)、陰性對照組(GV249)、低表達miR-22組(GV249/miR-22-siRNA),利用RT-qPCR和Western blot檢測以上各組細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。4.轉(zhuǎn)染HMGB1shRNA真核質(zhì)粒,利用RT-qPCR和Western blot檢測細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。將細胞分為正常組(N)、陰性對照組(GV102)、低表達HMGB1組(GV102/HMGB1-siRNA)。CCK-8法檢測各組細胞的增殖,細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移,Transwell實驗觀察各組細胞侵襲的細胞數(shù),流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。5.轉(zhuǎn)染過表達HMGB1真核質(zhì)粒,利用RT-qPCR和Western blot檢測細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1,將細胞分為N,GV251/miR-22,GV251/miR-22+GV230,GV251/miR-22+GV230/HMGB1四組,CCK-8法檢測各組細胞的增殖,細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移,Transwell實驗觀察各組細胞侵襲的細胞數(shù),流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。6.Y79細胞分為N,GV251/miR-22,GV102/HMGB1-siRNA,GV230/HMGB1,GV251/miR-22+GV230/HMGB1五組,Western blot觀察各組細胞AKT和p-AKT的表達。結(jié)果1.轉(zhuǎn)染過表達miR-22真核質(zhì)粒明顯上調(diào)miR-22的表達(P0.05)。與陰性對照組相比,過表達miR-22組細胞的增殖減低,遷移率降低,細胞侵襲的細胞數(shù)減少,細胞的凋亡率增加。提示上調(diào)miR-22抑制細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞的凋亡。2.與對照組相比,過表達miR-22組細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平明顯降低。3.轉(zhuǎn)染miR-22shRNA真核質(zhì)粒明顯降低miR-22的表達(P0.05)。與對照組相比,低表達miR-22組細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平明顯增加。4.轉(zhuǎn)染HMGB1shRNA真核質(zhì)粒,明顯降低細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。與陰性對照組相比,低表達HMGB1組細胞的增殖減低,遷移率降低,細胞侵襲的細胞數(shù)減少,細胞的凋亡率增加。提示敲低HMGB1的表達抑制細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞的凋亡。5.轉(zhuǎn)染過表達HMGB1真核質(zhì)粒,明顯提高細胞HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。與GV251/miR-22+GV230組相比,共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1組細胞的增殖和遷移力增強、侵襲的細胞數(shù)增多、細胞的凋亡率減低。提示共轉(zhuǎn)染miR-22和HMGB1逆轉(zhuǎn)了過表達miR-22對細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。6.Western blot結(jié)果顯示GV251/miR-22和GV102/HMGB1-siRNA組AKT的磷酸化水平較正常組明顯減低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GV230/HMGB1組AKT的磷酸化水平較正常組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。共轉(zhuǎn)染組AKT磷酸化水平較GV251/miR-22組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論上調(diào)miR-22顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞的凋亡。miR-22在Y79細胞中負向調(diào)節(jié)HMGB1的表達,miR-22通過HMGB1發(fā)揮抑制細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞的凋亡的作用。PI3K/AKT通路參與miR-22/HMGB1對Y79細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.7
【圖文】：

B圖 1-1 GV251/miR-22 重組質(zhì)粒 PCR 及基因測序鑒定結(jié)果。(A) GV251/miR-22 重組質(zhì)粒PCR 結(jié)果。(B) GV251/miR-22 重組質(zhì)�；驕y序結(jié)果。Fig1-1 PCR and gene sequencing results of miR-22 overexpression recombinant plasmid. (A)PCR result of GV251/miR-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing result of GV251/miR-22recombinant plasmid．2.2 轉(zhuǎn)染 GV251/miR-22 對 miR-22 表達水平的影響為了研究 miR-22 在視網(wǎng)膜母細胞瘤中具體的生物學(xué)功能，我們在上海吉凱基因公司構(gòu)建成功 miR-22 過表達重組質(zhì)粒 GV251/miR-22，轉(zhuǎn)染 Y79 細胞上調(diào)miR-22 的表達水平。實驗分為 GV251/miR-22，GV251，N 三組，U6 作為內(nèi)參，用 RT-qPCR 檢測各組細胞 miR-22 的表達水平。如圖 1-2 所示，GV251/miR-22

iR-22 重組質(zhì)�；驕y序結(jié)果。quencing results of miR-22 overexpression re-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing -22 對 miR-22 表達水平的影響 在視網(wǎng)膜母細胞瘤中具體的生物學(xué)功能iR-22 過表達重組質(zhì)粒 GV251/miR-22，實驗分為 GV251/miR-22，GV251，N 三細胞 miR-22 的表達水平。如圖 1-2 所調(diào) miR-22 水平（約 1 倍），差異有統(tǒng)

quantitative PCR detected the effect of miR-22 oveession level of miR-22. U6 is set as an internal 1 group.細胞增殖的影響CK-8 實驗觀察上調(diào) miR-22 對細胞增殖的251,N 三組，轉(zhuǎn)染 GV251/miR-22 后 0h，6殖的影響。6h GV251/miR-22 組較 GV2512h，24h，48h GV251/miR-22 組較 GV251 組統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。也就是說，上調(diào) miR2 組較 GV251 組顯著抑制細胞的增殖。

【參考文獻】

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本文編號：2770459