【摘要】：研究目的甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是眼眶疾病中最常見的一種類型。目前的研究認(rèn)為其是一種自身免疫性疾病,與甲狀腺功能紊亂有關(guān),常伴發(fā)于毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves’disease,GD)。國(guó)外研究顯示,每百萬人群中Graves病發(fā)病率為210/年,男女比例為1:3.9,高峰年齡為40-60歲,而TAO的發(fā)病率為42.2/百萬/年,約為Graves甲亢發(fā)病率的20.1%。目前TAO的確切發(fā)病機(jī)制仍不明確,缺乏針對(duì)性的治療措施,現(xiàn)有治療方案多以控制病情為主。同時(shí)由于TAO治療的前提是正確的臨床分期,而目前臨床普遍采用的CAS評(píng)分系統(tǒng)存在一定的主觀性,尤其對(duì)于非專門從事TAO診治的眼科和全科醫(yī)生,很難做到準(zhǔn)確分期。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9)激活可促進(jìn)漿細(xì)胞樣DC(pDC)分泌IFN-α,與SLE的疾病活動(dòng)性和預(yù)后密切相關(guān)。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期TAO患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR9表達(dá)明顯高于正常人群。因此我們推測(cè)TLR9是否同樣參與了TAO的發(fā)病過程,為了驗(yàn)證這一設(shè)想,通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活動(dòng)期TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞(orbital fibroblasts,OFs)是否高表達(dá)TLR9,并與穩(wěn)定期TAO進(jìn)行對(duì)比,以期發(fā)現(xiàn)二者之間TLR9表達(dá)的差異。進(jìn)一步探究TLR9與OFs增殖、炎癥因子釋放之間的聯(lián)系,了解TLR9在TAO發(fā)病中的作用,為尋找TAO治療靶點(diǎn)提供依據(jù)和方向。研究方法本課題通過組織塊培養(yǎng)法,分別從活動(dòng)期TAO患者、穩(wěn)定期TAO患者及排除免疫性疾病為改善外觀而行眼眶減壓手術(shù)的正常人眼眶脂肪結(jié)締組織中分離純化OFs。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)方法分析各組TLR9mRNA表達(dá)水平的差異。用TLR9特異性配體——人工合成的含有CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)刺激各組細(xì)胞,分別于刺激后0h、6h、12h、24h用qRT-PCR方法檢測(cè)白介素-6(interleukins-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì),并分別用不同濃度CpG ODN刺激各組OFs,作用不同時(shí)間,通過CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞OD值的變化,計(jì)算細(xì)胞活力,了解TLR9與OFs增殖之間的聯(lián)系。最后用特異性小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)下調(diào)TLR9 mRNA的表達(dá)水平,再次用qRT-PCR法檢測(cè)活動(dòng)期TAO組TLR9、IL-6、IFN-γ、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平,驗(yàn)證TLR9與炎癥因子IL-6、IFN-γ、ICAM-1合成和分泌之間的相關(guān)性。結(jié)果1、經(jīng)組織塊培養(yǎng)法成功獲得各組OFs,經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫組化鑒定符合成纖維細(xì)胞特征。2、TLR9 mRNA在活動(dòng)期TAO組OFs中表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,而在穩(wěn)定期TAO組中表達(dá)下調(diào)。3、CpG-ODN刺激各組細(xì)胞后,活動(dòng)期TAO組OFs活力明顯升高,而穩(wěn)定期TAO組和正常對(duì)照組無明顯變化,這種作用在CpG-ODN作用48h后顯現(xiàn),并且存在劑量依賴,在200nM時(shí)最明顯。4、CpG-ODN刺激各組細(xì)胞后,活動(dòng)期TAO組OFs相關(guān)炎癥因子(IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ)mRNA的表達(dá)水平均不同程度升高,穩(wěn)定期TAO組OFs升高幅度不明顯,部分出現(xiàn)下調(diào)。5、用siRNA下調(diào)活動(dòng)期TAO組OFs TLR9 mRNA表達(dá)水平后,相關(guān)炎癥因子(IL-6、IFN-γ、ICAM-1)mRNA的表達(dá)水平亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì),呈正相關(guān)。結(jié)論1、組織塊培養(yǎng)法獲取OFs是可靠而有效的。2、TAO活動(dòng)期患者來源的OFs高表達(dá)TLR9,而穩(wěn)定期患者來源的OFs相對(duì)低表達(dá),提示TLR9可能參與TAO活動(dòng)期炎癥反應(yīng)過程。3、用特異性配體激活TLR9后,OFs的細(xì)胞活力明顯提高,提示TLR9被激活可能參與了TAO活動(dòng)期眼外肌增生和眶脂肪增多的病理過程。4、TLR9激活后,可誘導(dǎo)活動(dòng)期OFs合成和分泌IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ等炎癥因子,說明TLR9可能參與了TAO活動(dòng)期眼眶炎癥反應(yīng)過程。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R581;R771.3
【圖文】：

圖 2.細(xì)胞鑒定結(jié)果，A. Vimentin 染色（+）（×400），B.CK 染色（-）（×400），C. Desm色（-）（×400），D. S-100 染色（-）（×400）二、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）測(cè)各組 OFs 中 TLR9 mRNA 表達(dá)水平

圖 3.三組 OFsTLR9 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平CpG-ODN 激活 TLR9 后，OFs 增殖活力的）、時(shí)間效應(yīng)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后，按 5×103cell/孔接種于 96 孔

圖 4.CpG-ODN（200nM）刺激后各組細(xì)胞活力時(shí)間曲線）、劑量效應(yīng)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后，按 5×103cell/孔接種于 96 孔板中CO2 孵箱培育 24 小時(shí)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別給予不同濃度 小時(shí)后進(jìn)行 CCK8 實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各孔 OD 值（剔除每組數(shù)據(jù)中偏差

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張合喜;鄒立君;王友潔;呂斌;周宜開;;用PCR-SSCP方法檢測(cè)TLR9基因多態(tài)性[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期

2 李寧;TLR9免疫識(shí)別CpG DNA的機(jī)制與途徑[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2003年05期

3 邢亞瓊;吳雪菁子;宋繼權(quán);;Toll樣受體9基因多態(tài)性與湖北漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的關(guān)系[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2018年09期

4 胡建龍;楊海英;鞠海兵;;Toll樣受體9與2型糖尿病足潰瘍的研究進(jìn)展[J];華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;2017年11期

5 王曉莉;何振娟;;Toll樣受體9與感染性疾病[J];安徽醫(yī)學(xué);2014年12期

6 鮑文朵娜;施少林;;Toll樣受體9的功能及其致病機(jī)制[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2016年05期

7 王峻梅;付永貴;劉澤寰;肖文娟;;廣東漢族人群TLR9基因單核苷酸多態(tài)性及其單倍型(英文)[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年03期

8 李寧,范學(xué)工,陳立章,陳朝暉,劉洪波;CpG-ODN活化人NK細(xì)胞的初步研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2005年06期

9 楊憲魯;王海燕;湯華曉;叢濤;李玲芳;;結(jié)節(jié)性紅斑患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體9和NF-κB的表達(dá)和意義[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2018年26期

10 葉玲;潘慶軍;唐德q

本文編號(hào)：2754506