發(fā)布時間：2017-03-29 18:25

  本文關(guān)鍵詞：RNAi抑制黃斑部脈絡(luò)膜新生血管形成的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 黃斑是人視覺最關(guān)鍵、最敏銳的部位,多種原因均可以導(dǎo)致黃斑部病變,如光損傷、炎癥、外傷、變性、腫瘤等等,�？芍虏豢赡孓D(zhuǎn)的視功能障礙。如：老年性黃斑病變(Age-related macular degeneration, AMD)、病理性近視(pathological myopia, PM)、息肉樣脈絡(luò)膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)和特發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管(idiopathic choroidal neovascularization, ICNV)等等,這些疾病引起眼底改變的病理基礎(chǔ)就是脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal neovascularization, CNV)的生成,若不加以干預(yù)治療,最終發(fā)展均會導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能的損害,致盲率很高。黃斑部發(fā)生變性時,脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層-Bruch's膜-視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)以及視網(wǎng)膜外層的神經(jīng)細(xì)胞均發(fā)生變性,直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織細(xì)胞慢性缺氧、缺血而致使細(xì)胞變性、萎縮等,并使視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管基底膜以及Bruch's膜發(fā)生萎縮或增殖。由于脈絡(luò)膜微血管發(fā)生了病變,破壞了RPE的屏障功能和吞噬功能,從而破壞了對視網(wǎng)膜內(nèi)層感光細(xì)胞的保護(hù)作用,嚴(yán)重影響視功能。黃斑變性的主要眼底表現(xiàn)為色素脫落或色素增殖、硬性及軟性玻璃膜疣(drusen)、滲出、水腫、出血以及最終脈絡(luò)膜新生血管的形成(CNV)。 在關(guān)于觸發(fā)CNV的眾多機制中,主要有血管內(nèi)皮生長因子(vascular enthothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(angiopoietin, Ang)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及粘附因子(adhesionmolecule, AM)等等,其中血管內(nèi)皮生長因子與抗血管生成因子(anti-angiogenesis factors)之間的失衡尤為重要。VEGF是一種分泌性蛋白質(zhì),它可以增加血管通透性,引發(fā)炎癥,誘發(fā)新生毛細(xì)血管生成。VEGF廣泛分布于人和動物體內(nèi)的多種組織結(jié)構(gòu)中,如大腦、肝臟、腎臟及眼部等等,其中在眼部視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的周細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞均存在VEGF,這對維持眼部血管完整性起了重要作用。在正常情況下,眼部組織中VEGF蛋白或VEGF蛋白的mRNA的表達(dá)水平很低,但是在缺血、缺氧、炎癥等應(yīng)激情況下,VEGF的蛋白與mRNA的表達(dá)水平均會明顯增高,從而誘導(dǎo)病態(tài)的新生血管的形成。 大量實驗研究證實,在機體組織新生血管的發(fā)生、發(fā)展過程中,VEGF起主要作用,VEGF的過度表達(dá)會促進(jìn)新生血管的形成。因此,眾多的學(xué)者在研究針對黃斑部CNV的治療藥物時,都不約而同的將VEGF作為潛在的治療目標(biāo),比如以VEGF適配子形式出現(xiàn)的哌格太尼(Pegaptanib)或者以抗VEGF抗體片段形式出現(xiàn)的蘭尼單抗(Ranibiumab)等。當(dāng)前,針對VEGF的抑制劑,主要有以下這些：Pegaptanib、Ranibiumab、Bevacizumab、VEGF-trap、KH902等,雖然這些藥物對眼部的新生血管有顯著的抑制效果,然而這些治療方法也存在一些不可忽視的問題,主要體現(xiàn)在以下兩點：首先由于病灶處局部微環(huán)境的病理變化導(dǎo)致VEGF持續(xù)分泌,而以上藥物玻璃體腔注射后不能長期在患部存在,即使應(yīng)用了各種藥物緩釋技術(shù),仍無法達(dá)到長期抑制VEGF的需求：更為重要的是這些藥物與VEGF結(jié)合屬于抗原抗體反應(yīng),則必然有抗原抗體復(fù)合物的生成,由于這些復(fù)合物的代謝較為困難,可能存在加重drusen的危險。所以我們認(rèn)為,抗VEGF藥物的作用主要在于局部中和病灶處產(chǎn)生的VEGF,而不能抑制病灶處VEGF因子的繼續(xù)生成,因而無法避免CNV的復(fù)發(fā),理論上來說,抑制VEGF的產(chǎn)生將比降解它更有利于CNV的治療。 當(dāng)前針對CNV的治療,除了上述的抗VEGF藥物,另一經(jīng)典有效的治療方法就是光動力療法(photodynamic therapy, PDT),維替泊芬-PDT于2000年正式被美國FDA批準(zhǔn)用于治療黃斑區(qū)的CNV,此種方法是采取靜脈內(nèi)注射光敏劑-維替泊芬,而后其與血管內(nèi)低密度脂蛋白相結(jié)合,聚集在眼部病灶新生血管處,再用一種特定波長的激光照射眼底病灶,照射范圍稍大于眼底血管造影檢查所確定的新生血管范圍,光敏劑受激光激發(fā)后可以把能量傳遞給周圍的氧,生成強活性的單態(tài)氧,單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng),產(chǎn)生自由基等細(xì)胞毒性物質(zhì),并直接作用于CNV使之破壞,并促使局部微血栓的形成,從而使病灶處新生血管發(fā)生閉塞,最終導(dǎo)致新生血管萎縮。PDT可以有效的封閉視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜的新生血管,雖對正常的視網(wǎng)膜組織基本沒有損傷,但可造成局部組織缺氧；PDT療法也有其局限性,只能封閉已經(jīng)形成的新生血管,且病灶區(qū)治療后有可能產(chǎn)生瘢痕。盡管PDT為CNV的治療提供了一個新的思路,然而同抗VEGF藥物一樣,也存在病變區(qū)CNV的復(fù)發(fā)問題。因此,治療并預(yù)防黃斑區(qū)CNV惡性發(fā)展的關(guān)鍵在于有針對性的降低VEGF的產(chǎn)生,從而抑制CNV的形成,以及改善視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的微循環(huán)。 隨著對眼部的新生血管相關(guān)因子的深入研究,基因治療成為目前較具潛力的眼部新生血管性疾病的治療對策,尤其是近10年來興起的核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù),不但為研究生物體的基因表達(dá)和調(diào)控等功能提供了新方法,同時也為眼部新生血管性疾病的研究、預(yù)防與治療開辟了新途徑、新領(lǐng)域。在基因治療方面,RNAi是沉默特定基因的強有力工具,被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。RNAi由一種小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)聽介導(dǎo),是引起生物細(xì)胞內(nèi)特異同源靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的基因表達(dá)調(diào)控機制,普遍存在于各種生物體內(nèi)。siRNA由21-23個核苷酸組成,為RNaseⅢ裂解外源或內(nèi)源性長的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNAs)分子所形成。在眼部新生血管性疾病的治療研究方面,以VEGF及其受體VEGFR為靶基因,對體外合成的siRNA或dsRNA進(jìn)行,結(jié)果顯示,相應(yīng)的siRNA可明顯降低VEGF或VEGFR的表達(dá)水平,減輕VEGF對新生血管形成的誘導(dǎo)作用,抑制眼部新生血管形成,但體外方法無法大量合成siRNA或dsRNA,而且siRNA不穩(wěn)定、細(xì)胞通透性差、需反復(fù)使用,使其應(yīng)用受到極大限制,無法普及應(yīng)用。 目前,激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型是我們最常用的方法之一,而CNV制模成功的關(guān)鍵在于Bruch's膜的破裂：CNV是脈絡(luò)膜的新生血管通過破損的Bruch's膜生長入視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下,因此如果激光能量過低而不能擊穿Bruch's膜,或激光時功率過大,導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織破壞而瘢痕化,都不能形成有效的CNV模型。目前通常是根據(jù)操作者的經(jīng)驗(觀察激光斑有無出血、氣泡等)來判斷Bruch's膜是否被擊穿,因此CNV模型成功率都不高。3D-OCT(光學(xué)相干斷層掃描)問世以來,為視網(wǎng)膜的疾病提供了一種全新的診斷指標(biāo),快速無創(chuàng),且可清晰顯示包括Bruch's膜在內(nèi)視網(wǎng)膜橫斷面各層結(jié)構(gòu),與傳統(tǒng)的時域OCT相比,頻域OCT具有高分辨率成像和實時動態(tài)的優(yōu)點,還能清楚的反映出CNV與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層及視網(wǎng)膜色素上皮層之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)�？煞窭�3D-OCT直視下引導(dǎo)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV模型,從而相比于傳統(tǒng)肉眼下CNV造模,顯著提高CNV模型制備的成功率呢? 本研究擬采用Long-Evans色素大鼠,以其VEGF的mRNA調(diào)控區(qū)為靶基因,構(gòu)建能表達(dá)作用于調(diào)控區(qū)的長發(fā)夾dsRNA(long-hairpin RNA,1hRNA)的質(zhì)粒,并注射至正常色素大鼠玻璃體腔內(nèi),然后對接受質(zhì)粒注射的大鼠進(jìn)行3D-OCT引導(dǎo)下激光誘導(dǎo)CNV,研究VEGF mRNA干擾質(zhì)粒對CNV形成的抑制作用。研究玻璃體腔注射質(zhì)粒后,能否在大鼠體內(nèi)表達(dá)形成特異性的1hRNA,并觀察此質(zhì)粒對大鼠CNV的形成是否有抑制作用,期望通過沉默VEGF-mRNA的調(diào)控區(qū)來降低VEGF的產(chǎn)生,同時破壞mRNA的穩(wěn)定性,達(dá)到抑制眼部新生血管形成的作用。該方法能克服體外合成siRNA的諸多不足,為治療應(yīng)用提供實驗與理論依據(jù)。同時,將為眼部新生血管性疾病的治療開辟新途徑,提供新思路和新方法。 本課題從以下三個方面進(jìn)行研究后得到如下結(jié)果和結(jié)論： 第一部分：VEGF基因RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 目的 構(gòu)建干擾大鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因RNA表達(dá)的重組質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究該RNAi質(zhì)粒在脈絡(luò)膜新生血管形成中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法 以Long-Evans大鼠VEGF為靶基因,以pcDNA3.1為質(zhì)粒載體,設(shè)計3組針對VEGF基因的RNA干擾(RNA interference,RNAi)序列,應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆入載體pcDNA3.1中,重組質(zhì)粒分別命名為pcDNA3.1-VEGF-LH1、 pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,并用DNA直接測序法和雙酶切法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒。 結(jié)果 DNA測序證實克隆入載體pcDNA3.1(-)中的序列正確,雙酶切、PCR結(jié)果顯示有目的片段的釋放,證實RNA干擾序列正確插入載體pcDNA3.1(-)。 結(jié)論 成功構(gòu)建針對VEGF基因的RNAi質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF-LHl. pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,為進(jìn)一步研究該RNAi質(zhì)粒在脈絡(luò)膜新生血管形成中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：3D-OCT可視引導(dǎo)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV模型 目的 在3D-OCT可視引導(dǎo)下,采用氪紅激光誘導(dǎo)色素大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型,觀察大鼠CNV模型成功效率。 方法 24只Long-Evans大鼠隨機分2組,每組12只。均選取右眼為實驗眼,進(jìn)行氪紅激光誘導(dǎo)大鼠CNV:A組為對照組,非3D-OCT引導(dǎo)；B組為實驗組,即在3D-OCT可視引導(dǎo)下行激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型。A組在視乳頭周圍I-2PD處予氪激光8點,激光時肉眼觀察到有氣泡產(chǎn)生或少量出血。B組在眼底激光光凝的同時,以3D-OCT同步掃描,選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點。光凝3周后行眼底照相、眼底血管造影檢查及3D-OCT檢查,比較兩組大鼠CNV模型的成功率。 結(jié)果 光凝后3周,觀察到A、B兩組視網(wǎng)膜水腫均基本消退,可見灰白色激光斑、少數(shù)出血斑周圍見黃白色滲出物,熒光素滲漏。其中A組可見57點出現(xiàn)Bruch's膜破裂、38點出現(xiàn)CNV,B組96點激光斑Bruch's膜均破裂、73點出現(xiàn)CNV。χ2檢驗兩組有顯著性差異(P0.05)。Bruch's膜破裂與CNV出現(xiàn)率呈高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.64。 結(jié)論 成功誘導(dǎo)CNV模型的關(guān)鍵是Bruch's膜的破壞,3D-OCT直視下引導(dǎo)氪激光誘導(dǎo)為實驗性CNV模型能提高模型的成功率,也為進(jìn)一步研究RNA干擾質(zhì)粒在色素大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)形成中的作用奠定基礎(chǔ)。 第三部分：PNA干擾質(zhì)粒對激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV形成的抑制作用 目的 驗證RNA干擾質(zhì)粒對激光誘導(dǎo)大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的形成是否有抑制作用。 方法 24只Long-Evans大鼠隨機分2組,每組12只。均選取右眼為實驗眼,A組為空白對照組,在3D-OCT引導(dǎo)下行氪激光誘導(dǎo)CNV; B組為實驗組,右眼玻璃體腔注射RNA干擾質(zhì)粒后,在3D-OCT引導(dǎo)下行氪激光誘導(dǎo)CNV。在視乳頭周圍1-2PD處予氪激光光凝,激光同時3D-OCT同步掃描,選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點。光凝3周后行眼底照相、3D-OCT及眼底血管造影檢查,比較兩組大鼠CNV模型的成功率。 結(jié)果 3周后,A組全部96點激光斑均出現(xiàn)Bruch's膜破裂、68點出現(xiàn)CNV, B組96點Bruch's膜破裂、19點出現(xiàn)CNV。χ2檢驗兩組有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論 玻璃體腔注射RNA干擾質(zhì)粒能夠有效的預(yù)防動物模型CNV的形成。
【關(guān)鍵詞】：血管內(nèi)皮生長因子 RNA干擾 重組質(zhì)粒 脈絡(luò)膜新生血管 光學(xué)相干斷層掃描Bruch's膜
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.5
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-22
• 第一部分：VEGF基因RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定22-39
• 1.1 材料22-25
• 1.2 實驗方法25-31
• 1.3 結(jié)果31-32
• 1.4 結(jié)論32
• 1.5 討論32-35
• 附圖35-39
• 第二部分：3D-OCT可視引導(dǎo)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV模型39-48
• 2.1 材料39-40
• 2.2 方法40-41
• 2.3 結(jié)果41-42
• 2.4 結(jié)論42
• 2.5 討論42-46
• 附圖46-48
• 第三部分：RNA干擾質(zhì)粒對激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV形成的抑制作用48-57
• 3.1 材料49-50
• 3.2 方法50-51
• 3.3 結(jié)果51-52
• 3.4 結(jié)論52
• 3.5 討論52-55
• 附圖55-57
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 綜述 黃斑部脈絡(luò)膜新生血管的治療進(jìn)展59-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 成果70-71
• 致謝71-73

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：RNAi抑制黃斑部脈絡(luò)膜新生血管形成的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：275147