【摘要】：目的:下咽癌(Hypopharyngeal carcinoma)是下咽區(qū)域主要的惡性腫瘤,占所有頭頸部惡性腫瘤的1.4%至5.0%,占全身惡性腫瘤的0.5%。其特點是發(fā)病部位較隱匿,患者預(yù)后較差。下咽鱗狀細胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)具有局部侵襲性生長及粘膜下浸潤的特點,并且易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,甚至遠處轉(zhuǎn)移。有50%的病例,在就診時出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此,在下咽癌的治療上,為了能做到早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療,提高患者的生存率,我們迫切的需要探究下咽癌的分子生物基礎(chǔ),尋找其發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的機制,找到針對下咽癌的靶向治療方法,這些都是具有十分重要意義的。Micro-RNAs(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞生物中,序列高度保守,調(diào)節(jié)基因表達的非蛋白編碼RNAs。研究表明,micro RNA可以充當(dāng)致癌基因和(或)抑癌基因的角色。microRNA可以通過同時靶向調(diào)控幾種mRNA來協(xié)調(diào)復(fù)雜呈網(wǎng)絡(luò)的腫瘤內(nèi)部分子蛋白機制。在頭頸腫瘤系統(tǒng)中,口腔鱗癌、舌鱗癌、喉鱗癌、鼻咽癌均有報道m(xù)iRNA具有差異化的表達。但相比其他頭頸腫瘤,針對下咽癌開展的miRNAs的研究卻不多。如果我們能找到具有代表性的miRNAs,建立與下咽癌分子機制間的關(guān)系,就將對下咽癌的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移等機制的研究做出重要貢獻。材料與方法:H-E染色確認術(shù)中收集的組織標(biāo)本,免疫組化染色檢測下咽癌組織中SMURF1的陽性表達情況。生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測SMURF1與miR-194-5p的靶向關(guān)系,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實。Real-Time PCR及western blot檢測下咽癌組織中miR-194-5p、SMURF1的表達情況。人咽鱗癌細胞系FaDu細胞培養(yǎng)、觀察及傳代。miR-194-5p模擬物及陰性對照、miR-194-5p抑制劑及陰性對照分別轉(zhuǎn)染FaDu細胞。利用CCK-8及Transwell檢測各轉(zhuǎn)染組細胞增殖和侵襲的變化。Real-Time PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染以上轉(zhuǎn)染各組SMURF1 m RNA和蛋白的表達變化。再向各組加入m TOR信號通路的特異性抑制劑雷帕霉素后,觀察mTOR、p-mTOR的表達變化情況。CCK-8及Transwell檢測各組FaDu細胞增殖和侵襲能力的變化。si RNA干擾瞬時沉默SMURF1后,觀察p-m TOR的蛋白表達變化。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±STDEV)來表示,采用SPSS17.0版本進行統(tǒng)計分析,采用獨立樣本t檢驗與配對t檢驗進行組間的比較分析,miR-194-5p與臨床病理特征之間的組間比較采用χ~2檢驗,miR-194-5p與SMURF1之間的比較采用Spearman相關(guān)分析,*P0.05、**P0.01代表具有顯著性差異。實驗結(jié)果:1.下咽癌臨床標(biāo)本的H-E染色H-E染色下,下咽癌組織細胞排列紊亂,細胞核比例大染色深,上皮細胞內(nèi)可見癌巢,形成的鱗狀上皮細胞團塊.2.下咽癌組織標(biāo)本中miR-194-5p的表達水平Real-time PCR實驗證實與癌旁正常組織相比,miR-194-5p在癌組織中的表達下調(diào),miR-194-5p的表達量的高低與年齡、性別因素?zé)o明顯相關(guān)性。但與原發(fā)腫瘤范圍的分期(T)及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在與否及范圍(N)具有相關(guān)性。3.miR-194-5p對FaDu細胞增殖和侵襲能力的影響miR-194-5p表達上調(diào)后,FaDu細胞的增殖能力下降,侵襲細胞數(shù)目減少;miR-194-5p表達下調(diào)后,FaDu細胞的增殖能力提高,侵襲細胞數(shù)目增多,證明miR-194-5p負向調(diào)控FaDu細胞的增殖和侵襲。4.下咽癌組織標(biāo)本中SMURF1的表達水平對標(biāo)本行免疫組化染色發(fā)現(xiàn),SMURF1在癌組織中的免疫反應(yīng)陽性率高于癌旁。Real-time PCR、Western Blot也證實,在癌組織中SMURF1mRNA和蛋白水平表達上調(diào),而在癌旁正常組織中表達下調(diào)。統(tǒng)計分析與miR-194-5p的表達呈負相關(guān)。5.雙熒光素酶報告基因檢測miR-194-5p與SMURF1之間具有靶向關(guān)系SMURF1-wtUTR與hsa-miR-194-5p mimic共轉(zhuǎn)染FaDu細胞,與對照組相比,熒光活性明顯下降,證明SMURF1與miR-194-5p靶向結(jié)合。6.過表達或低表達miR-194-5p后,SMURF1表達的變化SMURF1的表達在miR-194-5pmimic組被抑制,在miR-194-5pinhbitor組被上調(diào)。7.各轉(zhuǎn)染組加入雷帕霉素后mTOR及p-m TOR蛋白表達的變化miR-194-5p mimic+雷帕霉素組的p-mTOR表達量顯著減少,說明miR-194-5p的過表達下調(diào)了p-mTOR,與抑制劑雷帕霉素具有協(xié)同作用。miR-194-5p inhbitor+雷帕霉素組的p-mTOR含量有明顯回升,雖未達到miR-194-5p inhbitor組水平,但與單獨加入雷帕霉素組相比,提高明顯,說明miR-194-5p的低表達敏感突出地調(diào)控了p-mTOR的含量,即使加入專一特異的抑制劑雷帕霉素,也只能部分削弱部分影響,反面證明了mTOR通路受miR-194-5p的調(diào)控。8.miR-194-5p調(diào)控mTOR信號通路對下咽癌FaDu細胞增殖和侵襲能力的影響過表達miR-194-5p與抑制mTOR信號通路有協(xié)同共促進作用,對FaDu細胞增殖與侵襲的抑制作用比單獨轉(zhuǎn)染mimic或單獨加入抑制劑更為顯著。miR-194-5p inhbitor+雷帕霉素組的Fa Du細胞增殖能力,與單獨加入雷帕霉素組相比,有明顯提高,但未達到mi R-194-5pinhbitor水平,說明雷帕霉素對于mTOR通路的抑制作用不足以完全拮抗miR-194-5p低表達導(dǎo)致的mTOR信號通路激活對FaDu細胞增殖和侵襲的上調(diào)作用。也證明了mTOR通路受miR-194-5p的調(diào)控。9.FaDu細胞轉(zhuǎn)染SMURF1 siRNA后,p-mTOR表達變化“沉默”了SMURF1,p-mTOR的表達明顯減少,證明了SMURF1表達下調(diào)導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達量減少,抑制了mTOR信號通路的活性。結(jié)論:1.下咽癌組織及細胞系中miR-194-5p低表達,其靶蛋白SMURF1高表達。2.miR-194-5p靶向結(jié)合SMURF1,當(dāng)miR-194-5p過表達時,SMURF1下調(diào),下咽癌細胞增殖及侵襲受到抑制。3.miR-194-5p靶向SMURF1調(diào)控mTOR信號通路,當(dāng)mi R-194-5p低表達,SMURF1表達上調(diào),mTOR信號通路激活,反之,miR-194-5p高表達,SMURF1表達下調(diào),mTOR信號通路受到抑制。本研究為探究下咽癌特異性的腫瘤標(biāo)記物,尋找可靠的靶向治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 下咽癌臨床標(biāo)本的 H&E 染色結(jié)果H&E 染色下，下咽癌組織中：細胞排列紊亂，細胞核比例大染色細胞內(nèi)可見癌巢，形成的鱗狀上皮細胞團塊，向真皮浸潤，棘細胞呈條狀細胞團瘤性增生，部分可見角化癌珠，周圍淋巴細胞、漿細胞浸潤。組織：細胞排列較整齊，形態(tài)清楚，輪廓清晰，細胞核染色較淺（圖

1-2 Real-time PCR 檢測 30 對臨床樣本中 miR-194-5p 的表達水平miR-194-5p 的表達水平顯著低于癌旁正常組織（**P<0.01）。下咽癌組織標(biāo)本中 miR-194-5p 的表達水平與下咽癌 TNM系臨床患者資料整理，進一步地探討 miR-194-5p 的表達與下咽癌病之間的關(guān)系,以 miR-194-5p 表達的中位數(shù) 1.126（2-△△Ct均值的中位值將 miR-194-5p 的表達量分為相對低表達和相對高表達，分94-5p 與下咽癌患者年齡、性別、TNM 分期間的關(guān)系。結(jié)果證實：miR量的高低與年齡、性別因素?zé)o明顯相關(guān)性。但與原發(fā)腫瘤范圍的分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在與否及范圍（N）具有相關(guān)性，差異具有顯著性（*P1-4）。

圖1-3 miR-194-5p mimic轉(zhuǎn)染FaDu細胞后的表達情況，,實驗組miR表達量明顯升高,實現(xiàn)了 miR-194-5p 的過表達（**P<0.01）.4.1 CCK-8 實驗檢測 miR-194-5p 對 FaDu 細胞增殖能力的影響miR-194-5p 表達上調(diào)后，對 FaDu 細胞的增殖有抑制作用，iR-194-5pmimic 在 48h、72h、96h 這三個時間點，與空白對照組及陰性比，明顯降低了 FaDu 細胞的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（**P<0.iR-194-5p 表達下調(diào)后，對 FaDu 細胞的增殖有促進作用，當(dāng) FaDu 細胞iR-194-5pinhbitor 后，在 24h、48h、72h、96h 這四個時間點，與空白對性對照組相比，F(xiàn)aDu 細胞的增殖能力明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P<0.01）（表 1-6，圖 1-4）。表 1-6 CCK-8 檢測不同時間點各轉(zhuǎn)染組吸光度 OD 值時間點 MEAN±STDEVp

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本文編號：2747193