發(fā)布時間：2020-07-03 18:14

【摘要】：感染性角膜炎是眼科臨床常見的致盲性疾病之一,主要的病原微生物有細(xì)菌、病毒和真菌等。大部分的細(xì)菌性和病毒性角膜炎對抗感染藥物的敏感性好,治愈率較高。真菌因其細(xì)胞壁厚,抗藥性強(qiáng),真菌性角膜炎的藥物治療效果不明顯。對于藥物治療無效的真菌性角膜炎等感染性角膜炎,必須采取角膜移植手術(shù),才可能控制感染,挽救視功能。受到角膜供體來源限制,這類患者往往失去手術(shù)時機(jī)導(dǎo)致視力嚴(yán)重?fù)p害、眼球萎縮甚至眼球摘除。 核黃素紫外線角膜交聯(lián)近年來已成功應(yīng)用于圓錐角膜的臨床治療。核黃素即維生素B2,是一種人體必需的維生素,在角膜交聯(lián)的過程中,受一定波長(365nm或370nm)紫外光照射,核黃素吸收能量轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài),產(chǎn)生氧自由基和單態(tài)氧,可導(dǎo)致微生物的核酸斷裂并阻止核酸復(fù)制,這一原理引起有關(guān)研究者的興趣。將核黃素角膜交聯(lián)應(yīng)用于真菌性角膜炎等難治性角膜感染疾病,有望達(dá)到既可以滅活病原微生物,又可以通過膠原纖維交聯(lián)增加角膜硬度及減少瘢痕形成。 目的本研究采用目前臨床通用的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的核黃素紫外線角膜交聯(lián)方法,探討核黃素角膜交聯(lián)在離體條件下對不同濃度的茄病鐮刀菌和白色念珠菌的滅活效應(yīng),以及其對兩種致病菌所致的新西蘭大白兔的實驗真菌性角膜炎的治療作用。 方法 1離體試驗：將分離純化所得的茄病鐮刀菌和白色念珠菌,分別用無菌的磷酸鹽緩沖液配制菌懸液,根據(jù)麥?zhǔn)蠞岫葍x調(diào)整濃度(茄病鐮刀菌菌懸液1.0麥?zhǔn)蠁挝粷岫认喈?dāng)于3×108CFU/ml,白色念珠菌菌懸液0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫认喈?dāng)于1.5×108CFU/ML),用無菌的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍配制兩種真菌菌懸液原液,以平板菌落計數(shù)法確定原液實際濃度。實驗分4組：對照組、核黃素組、紫外線組、角膜交聯(lián)組(核黃素+紫外線)。核黃素組和角膜交聯(lián)組的菌懸液均由所配原液加入適量PBS溶液和核黃素溶液后倍比稀釋所得,使菌懸液濃度等級分別約為106、105、104、103、102CFU/ml,最終核黃素濃度則均為0.1%。對照組、紫外線組的菌懸液不含核黃素,僅由上述原液加入適量PBS倍比稀釋,使菌懸液濃度等級分別約為106、105、104、103、102CFU/ml。各組的菌懸液均于每次實驗前半小時內(nèi)配制。角膜交聯(lián)組和紫外線組的菌懸液在潔凈工作臺避光進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)角膜交聯(lián)參數(shù)的紫外線照射,核黃素組和對照組培養(yǎng)板在潔凈工作臺避光保存(無紫外線照射)。時間均為30min。用平板菌落計數(shù)法計算并比較4組：對照組、核黃素組、紫外線組、角膜交聯(lián)組(核黃素+紫外線)各濃度等級菌懸液的殘留菌數(shù)(CFU/ml),以及各濃度等級菌懸液的抗菌率 2動物模型：經(jīng)角膜基質(zhì)注射法制造兩種致病菌的真菌性角膜炎的新西蘭大白兔模型。茄病鐮刀菌組和白色念珠菌組各20只。每只兔隨機(jī)1眼采用核黃素角膜交聯(lián)治療,茄病鐮刀菌組對側(cè)眼滴那他霉素滴眼液,白色念珠菌組對側(cè)眼滴酮康唑滴眼液治療。于治療前當(dāng)日和治療后第1,3,7日裂隙燈顯微鏡行角膜2%熒光素鈉染色檢查,測量角膜潰瘍的最大直徑,觀察前房反應(yīng)等。于第7,14日記錄兩組的交聯(lián)眼和藥物眼潰瘍愈合的眼數(shù)。于第14日將兩組的交聯(lián)眼和藥物眼未治愈者處死,取中央直徑9mm角膜片,立即稱重后培養(yǎng),72小時后菌落計數(shù)。另從兩組的交聯(lián)眼和藥物眼角膜潰瘍均愈合者各2眼處死,摘除眼球,角膜行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果 1核黃素角膜交聯(lián)可部分滅活低濃度的茄病鐮刀菌和白色念珠菌；在白色念珠菌菌懸液的各稀釋濃度中,角膜交聯(lián)組的殘留菌數(shù)均低于對照組、核黃素組和紫外線組(P0.01),對照組、核黃素組和紫外線組的殘留菌數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。角膜交聯(lián)組的抗菌率在濃度等級106、105、104、103、102CFU/ml的菌懸液中,分別為32.2%、33.1%、49.0%、57.8%、62.3%。抗菌率與菌懸液濃度對數(shù)轉(zhuǎn)換值之間的線性回歸擬合方程為抗菌百分率=82.043-8.452×菌懸液實際濃度(Lg值)(P0.01)。在茄病鐮刀菌菌懸液的104、103、102CFU/ml濃度中,角膜交聯(lián)組的殘留菌數(shù)均低于對照組、核黃素組和紫外線組(P0.01),對照組、核黃素組和紫外線組的殘留菌數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。角膜交聯(lián)組的抗菌率在濃度等級104、103、102CFU/ml的菌懸液中,分別為25.7%、28.2%、45.1%。抗菌率與菌懸液濃度對數(shù)轉(zhuǎn)換值之間的線性回歸擬合方程為抗菌百分率=66.060-9.567×菌懸液實際濃度(Lg值)(P0.01)。 2茄病鐮刀菌組中,交聯(lián)眼治療前潰瘍直徑,治療后第7日潰瘍直徑0.41±0.27mm,治療后與治療前比較有顯著性差異,藥物眼治療前潰瘍直徑,治療后第7日潰瘍直徑0.75±0.32mm,治療后與治療前比較有顯著性差異；治療后第7日,交聯(lián)眼潰瘍愈合15眼,藥物眼13眼,愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義,治療后第14日,交聯(lián)眼潰瘍愈合17眼,藥物眼13眼,愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療后第14日,交聯(lián)眼潰瘍未愈合5眼,茄病鐮刀菌含量34.74±8.17CFU/g,藥物眼潰瘍未愈合7眼,茄病鐮刀菌含量54.27±7.35CFU/g,差異有統(tǒng)計學(xué)意義白色念珠菌組中,交聯(lián)眼治療前潰瘍直徑,治療后第7日潰瘍直徑0.18±0.07mm,治療后與治療前比較有顯著性差異,藥物眼治療前潰瘍直徑,治療后第7日潰瘍直徑0.56±0.22mm,治療后與治療前比較有顯著性差異；治療后第7日,交聯(lián)眼潰瘍愈合16眼,藥物眼12眼,愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義,治療后第14日,交聯(lián)眼潰瘍愈合17眼,藥物眼14眼,愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療后第14日,交聯(lián)眼潰瘍未愈合3眼,白色念珠菌含量為28.63±7.79CFU/g,藥物眼潰瘍未愈合6眼,白色念珠菌含量44.15±6.48CFU/g,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組的交聯(lián)眼角膜組織切片顯示膠原纖維排列整齊緊密,瘢痕組織不明顯。 結(jié)論： 1.離體條件下,標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的核黃素角膜交聯(lián)方法對較低濃度的茄病鐮刀菌和白色念珠菌有部分滅活效應(yīng),抗菌率與菌液濃度對數(shù)值負(fù)相關(guān)。 2.標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的核黃素角膜交聯(lián)方法有效治愈兔模型的茄病鐮刀菌和白色念珠菌角膜炎,并有利于角膜組織修復(fù)。核黃素角膜交聯(lián)有望成為臨床治療真菌性角膜炎的新方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.21

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本文編號：2740005