【摘要】：目的研究PNUTS基因?qū)θ撕戆〩ep-2細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)化的影響,并初步探討其中可能的調(diào)控機制,以期為臨床上喉癌的治療提供新的靶點及理論依據(jù)。方法1.PNUTS基因siRNA重組腺病毒(Ad-siPNUTS)的構(gòu)建、最適MOI的篩選及效果鑒定(1)不同MOI值的腺病毒感染Hep-2細胞,以感染效率達80%以上為最適MOI。(2)RT-PCR 及 Western Blotting 檢測 Ad-siPNUTS 對 Hep-2 細胞PNUT mRNA和蛋白表達的影響。2.Ad-siPNUTS對喉癌細胞Hep-2生物學(xué)功能的影響(1)MTT法檢測Hep-2細胞增殖能力;(2)Transwell法檢測Hep-2細胞遷移、侵襲能力;(3)Western Blotting 檢測 Hep-2 細胞中 EMT 相關(guān)表型 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達。3.PNUTS調(diào)控Hep-2細胞的機制Western Blotting 檢測 PI3K、P-AKT、Rb 總蛋白、p-Rb、E2F1、ZEB1的表達。結(jié)果1.成功構(gòu)建靶向PNUTS基因的siRNA重組腺病毒Ad-siPNUTS;MOI值為100時感染效率達80%以上;RT-PCR及Western Blotting檢測結(jié)果表明,Ad-siPNUTS感染喉癌細胞Hep-2后,PNUTSmRNA及蛋白表達水平顯著降低(P0.05);2.MTT實驗表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2細胞后,與陰性對照組(Ad-GFP)相比,實驗組(Ad-siPNUTS)細胞增殖速度在第2(P=0.004)、3(=0.001)、4天(P=0.000)明顯減慢;陰性對照組(Ad-GFP)與空白對照組(PBS)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3.Transwell遷移實驗表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2細胞后,與Ad-GFP組相比,Ad-siPNUTS組細胞遷移能力顯著下降(P=0.000),Ad-GFP組與PBS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.372);4.Transwell侵襲實驗表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2細胞后,與Ad-GFP組相比,Ad-siPNUTS組細胞侵襲能力顯著下降(P=0.000);Ad-GFP組與PBS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.420);5 Western Blotting檢測結(jié)果表明,Ad-siPNUTS感染Hep-2細胞后,與 Ad-GFP 組相比,Ad-siPNUTS 組 E-cadherin(P=0.003)表達升高,總Rb(P=0.000)、p-Rb(P=0.000)、PI3K(P=0.023)、p-AKT(P=0.000)、N-cadherin(P=0.005)、ZEB1(P=0.000)、E2F1(P=0.000)表達降低;Ad-GFP組與PBS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1.靶向PNUTS基因的siRNA重組腺病毒載體可高效并特異性沉默PNUTS基因的表達。2.重組腺病毒載體Ad-siPNUTS可抑制喉癌細胞Hep-2的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的發(fā)生。3.PNUTS 對 Hep-2 細胞的調(diào)控可能與 PI3K/AKT、Rb/E2F1、Rb/ZEB1信號通路有關(guān)。4.PNUTS基因可能是喉癌基因治療的新靶點。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.65
【圖文】：

２．３邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細胞生物學(xué)行為的影響逡逑２．３．１邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細胞增殖能力的影響逡逑Ｈｅｐ－２細胞生長曲線（圖３）顯示：與Ａｄ－ＧＦＰ組相比，Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ組中Ｈｅｐ－２逡逑細胞生長速度在第２天日（ｉＭ）．００４）、第３天日００．００１）、第４天日００．０００）逡逑明顯減慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；Ａｄ－ＧＦＰ組和ＰＢＳ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑１＇５＇邐ＰＢＳ逡逑－ｍ－邋Ａｄ－ＧＦＰ逡逑１0邐－ｔ－邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ逡逑°邋°－５－邋＾逡逑ｏ．0Ｊ—ｉ邐１邐１邐１—逡逑Ｎ邐＜Ｖ邐ｆｃ－逡逑時間（ｄ）逡逑圖３邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細跑增殖的影響逡逑Ｆｉｇ邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ｏｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｈｅｐ－２邋ｃｅｌｌｓ逡逑？Ｐ＝０．００４

逑２．３．２邐Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細胞遷移能力的影響逡逑Ｔａｎｓｗｅｌｌ遷移實驗結(jié)果（圖４）顯示：ＰＢＳ組、Ａｄ－ＧＦＰ組及Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ組逡逑的細胞穿膜數(shù)分別為（３４３．００＋４．０１）個，（３３９．００＋７．５５）個，（１２５．３３＋２．０８）個；逡逑與Ａｄ－ＧＦＰ組相比，Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ組細胞穿膜數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義逡逑（Ｐ＝０．０００）邋；邋Ａｄ－ＧＦＰ與ＰＢＳ組差異無統(tǒng)計學(xué)意義００．３７２）。逡逑麟Ｉ邐＿栜＿＾｜邋：？、：娭２逡逑焌艦？：：馨懟逡逑．ＰＢＳ．組邐Ａｄ－ＧＦＰ．組邐Ａｄ－ｓｉＭＯＴＳｌＲ，逡逑圖４邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細胞遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色ｘ２００）逡逑Ｆｉｇ邋４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ｏｎ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｈｅｐ－２邋ｃｅｌｌｓ邋（邋ｘ２００）逡逑Ｐ＝０．０００，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｇｒｏｕｐ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｕｐ邋Ａｄ－ＧＦＰ逡逑２．３．３邐Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ對Ｈｅｐ－２細胞侵襲能力的影響逡逑Ｔａｎｓｗｅｌｌ侵襲實驗結(jié)果（圖５）顯示：ＰＢＳ組、Ａｄ－ＧＦＰ組及Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ組逡逑的細胞穿膜數(shù)分別為（３２５．６７＋４．１６）個，（３２２．３３＋３．２１）個，（８８．０１＋６．２５）個；逡逑Ａｄ－ＧＦＰ組相比

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何正波;陳斌;馮國忠;;昆蟲RNAi技術(shù)及其應(yīng)用[J];昆蟲知識;2009年04期

本文編號：2725607