發(fā)布時間：2020-06-18 12:11

【摘要】：目的:肌節(jié)同源盒基因同系物2(Muscle Segment Homeobox,Homolog of,2,Msx2)位于5號染色體長臂5q34-q35,編碼由263個氨基酸組成的蛋白質(zhì),它可以與核心轉(zhuǎn)錄復(fù)合物作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。以往研究多集中在Msx2對顱骨、乳腺等組織發(fā)育的影響上,但最新研究發(fā)現(xiàn)Msx2基因表達異�？捎绊懢铙w發(fā)育,導(dǎo)致小眼球畸形等多種先天性眼病。晶狀體作為眼屈光間質(zhì),具有屈光和調(diào)節(jié)的功能,實驗證明在小鼠圍產(chǎn)期移除晶狀體會導(dǎo)致眼前節(jié)多組織發(fā)育障礙,晶狀體功能不良也可直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜等眼組織發(fā)育障礙,說明晶狀體的發(fā)育在眼組織發(fā)育過程中所起的作用至關(guān)重要。晶狀體形態(tài)發(fā)生可分三個階段,包括晶狀體的誘導(dǎo)和決定、晶狀體形態(tài)發(fā)生及晶狀體細胞分化。脊椎動物的晶狀體來源于頭部的表皮外胚層,最早的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是形成晶狀體基板。晶狀體基板是與視泡相鄰的表皮外胚層增厚的區(qū)域,在視泡從前腦突出并與表皮外胚層緊密接觸之后才形成晶狀體基板。視泡與晶狀體基板之間的相互作用很強,并有細胞質(zhì)外延介導(dǎo)。在胚胎發(fā)育第10天,晶狀體基板和視泡的外層內(nèi)陷,形成晶狀體凹和視杯。胚胎發(fā)育第11天,晶狀體凹在表面外胚層閉合形成晶狀體泡。在這個時期,晶狀體凹面向視網(wǎng)膜一側(cè)的上皮細胞開始增厚,晶狀體泡后部的上皮細胞向前延伸分化成晶狀體纖維細胞。多年來國內(nèi)外學(xué)者對晶狀體發(fā)育過程以及其調(diào)控機制進行了大量研究�，F(xiàn)階段對于晶狀體發(fā)育過程的調(diào)控,國內(nèi)外學(xué)者主要從信號傳導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面進行研究:1)信號傳導(dǎo)通路:目前研究認為晶狀體發(fā)育過程涉及BMP、FGF及Wnt等多種信號傳導(dǎo)通路,對晶狀體的發(fā)育起重要作用;2)轉(zhuǎn)錄調(diào)控:晶狀體調(diào)節(jié)基因(Pax6,Meis,Six3等)和結(jié)構(gòu)基因(Crystallins,MIP/aquaporin0等)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與晶狀體發(fā)育全過程直接相關(guān),在晶狀體發(fā)育過程中形成不同時期不同位置的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),是晶狀體發(fā)育過程中最重要的調(diào)控途徑。任何晶狀體調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控出現(xiàn)異常,都會導(dǎo)致晶狀體發(fā)育異常。晶狀體細胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的機制之一,最近研究發(fā)現(xiàn)Msx2表達異常可以影響晶狀體發(fā)育過程,導(dǎo)致晶狀體發(fā)育障礙。但Msx2作為新發(fā)現(xiàn)的眼部發(fā)育調(diào)控基因,其在眼部發(fā)育過程中的具體功能及作用機理尚不清楚。本研究利用Msx2cko小鼠,通過觀察其晶狀體發(fā)育過程的變化,探討Msx2基因表達缺失對晶狀體早期發(fā)育的影響。方法:1、組織學(xué)方法制備發(fā)育E9.5至E12.5天的胚胎及P21眼球石蠟切片,常規(guī)蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察Msx2cko小鼠晶狀體發(fā)育形態(tài)的變化。2、免疫組化分析常規(guī)免疫熒光方法觀察,Msx2cko小鼠晶狀體譜系特定轉(zhuǎn)錄因子Pax6,Sox2,Ap2α及Prox1的表達強度變化。3、BrdU免疫組化分析BrdU標(biāo)記母鼠,制備胚胎發(fā)育E10.5石蠟切片,免疫組織化學(xué)方法觀察Msx2cko小鼠與Msx2~(flox/flox)小鼠晶狀體內(nèi)BrdU標(biāo)記細胞的變化。4、Tunel細胞凋亡檢測利用Tunel方法檢測Msx2cko小鼠胚胎發(fā)育E10.5晶狀體組織細胞凋亡,染色步驟按說明書進行,光鏡下,按照凋亡細胞的特異性熒光染色判斷凋亡細胞。5、LacZ染色觀察Le-Cre重組酶在發(fā)育中的晶狀體組織中特異性表達。用Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26R小鼠交配,取發(fā)育至E10.5,E13.5胚胎,在4%PFA中固定10分鐘,PBS洗3次,在X-gal染色液中4℃過夜。6、整胚原位分子雜交觀察Msx2cko小鼠胚胎晶狀體內(nèi)Msx2、Sox2、FoxE3的轉(zhuǎn)錄變化。以含有RNA聚合酶啟動子的cDNA質(zhì)粒為模板,利用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成RNA探針。取發(fā)育至E9.5-E12.5天小鼠胚胎,整胚原位分子雜交觀察Msx2cko小鼠晶狀體內(nèi)Msx2、Sox2、FoxE3的轉(zhuǎn)錄變化。7、基因芯片分析及實時定量PCR驗證應(yīng)用上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供的小鼠全基因組芯片,篩選Msx2cko和Msx2~(flox/flox) P1小鼠(n=3)晶狀體組織差異表達基因,并進行GO和KEGG分析差異基因。對差異表達基因進行GO分析篩選出凋亡相關(guān)基因,并取Msx2cko和Msx2~flox/floxlox/flox P1小鼠晶狀體組織RT-PCR進行基因芯片驗證。結(jié)果:從E10.5天開始,Msx2cko小鼠的晶狀體發(fā)育過程與Msx2~(flox/flox)小鼠相比受到抑制,表現(xiàn)為晶狀體泡發(fā)育位置正常但體積變小。至E12.5天,Msx2cko小鼠晶狀體上皮細胞分化不明顯,晶狀體明顯減小,并且晶狀體與角膜粘連,不分離。晶狀體與視網(wǎng)膜之間有神經(jīng)鞘細胞長入。在胚胎發(fā)育第10.5天,Msx2cko小鼠與Msx2~(flox/flox)小鼠相比,BrdU標(biāo)記細胞無明顯差異,但是凋亡細胞明顯增多。整胚原位分子雜交技術(shù)觀察到在胚胎E10.5天時,Msx2cko小鼠的晶狀體中可觀察到FoxE3在晶狀體內(nèi)表達水平下降,至E12.5天,FoxE3的表達完全缺失,而Msx2~(flox/flox)小鼠中FoxE3在胚胎E10.5-11.5天的晶狀體前部上皮細胞中明顯表達。其他晶狀體發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pax6、Sox2、Ap2α的表達在Msx2cko小鼠及Msx2~(flox/flox)小鼠中無差異、β晶體蛋白作為晶狀體發(fā)育的結(jié)構(gòu)蛋白,在兩種小鼠中的表達無明顯差異。在Msx2cko P1小鼠中Caspase-3和Caspase-8表達增加。結(jié)論:1、Msx2cko小鼠晶狀體發(fā)育異常,表現(xiàn)為小晶狀體,晶狀體與角膜組織分離遲緩。2、Msx2cko小鼠晶狀體細胞增殖不受影響,但凋亡增加,且Caspase-3和Caspase-8在Msx2cko小鼠晶狀體中表達增加,可能導(dǎo)致晶狀體發(fā)育遲緩的原因。3、Msx2基因敲除后通過抑制FoxE3基因的表達來調(diào)控晶狀體發(fā)育,Msx2不僅參與晶狀體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,而且在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于上游位置,在晶狀體發(fā)育過程中起到重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R77
【圖文】：

Cre 重組酶的啟動子為 Pax6 的 Le-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型用 PCR 方法來鑒定（圖1b）。用 Le-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠與 ROSA 報到小鼠交配，利用 LacZ 染色方法進行檢測，結(jié)果顯示Cre重組酶在發(fā)育中的晶狀體組織中特異性表達(圖1cE10.5 圖1dE13.5)。此外，利用整胚原位雜交技術(shù)觀察到在胚胎 E9.5 天時，Msx2mRNA 在 Msx2cko和Msx2flox/flox小鼠胚胎視泡中都有表達(圖2a，2b)；胚胎E10.5天開始，Msx2mRNA在 Msx2flox/flox小鼠胚胎視泡中表達，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎視泡中的表達完全缺失，證明 Msx2 基因在這一時期已經(jīng)失去功能(2c，2d)；在胚胎 E11.5 天時

和Msx2flox/flox小鼠胚胎視泡中都有表達(圖2a，2b)；胚胎E10.5天開始，Msx2mRNA在 Msx2flox/flox小鼠胚胎視泡中表達，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎視泡中的表達完全缺失，證明 Msx2 基因在這一時期已經(jīng)失去功能(2c，2d)；在胚胎 E11.5 天時，Msx2 mRNA 在 Msx2flox/flox小鼠胚胎晶狀體泡中表達，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎晶狀體泡中表達缺失（圖 2e

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本文編號：2719212