【摘要】：研究目的:先天性白內(nèi)障是造成兒童視力損害的主要原因之一,其中有約四分之一的患者發(fā)病與遺傳相關(guān)。晶狀體蛋白是晶狀體最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,比重大約占晶狀體中水溶性蛋白的90%,其中γS-晶狀體蛋白又是重要的晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白之一,對長期維持晶狀體的屈光性和透明性有著重要作用。研究先天性白內(nèi)障發(fā)生的具體機制有助于從根源上透徹了解相關(guān)突變基因的具體功能和致病途徑,從而使得從基因或者蛋白質(zhì)層面徹底預防先天性白內(nèi)障的發(fā)生成為可能。目前關(guān)于γS-晶狀體蛋白突變致先天性白內(nèi)障的報道相對較少,對γS-晶狀體蛋白致先天性白內(nèi)障的具體機制研究也不夠深入,所以本研究選取浙二眼科中心最近發(fā)現(xiàn)的兩個已報道的γS-晶狀體蛋白突變(G75V和G18D),研究突變對γS-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響,從而更加深入了解γS-晶狀體蛋白突變致先天性白內(nèi)障的具體分子機制。研究方法:通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和定點突變技術(shù)構(gòu)建.γS-晶狀體蛋白野生型和突變體的原核表達質(zhì)粒pET-28a,轉(zhuǎn)化至Rosetta大腸桿菌中大量誘導表達野生型及突變體蛋白并純化;利用生物物理學方法,如圓二色光譜、熒光光譜等技術(shù)研究突變對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響。同時構(gòu)建γS-晶狀體蛋白野生型和突變體的真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1,轉(zhuǎn)染至人胚腎上皮細胞Hek293T中進行過表達,在共聚焦激光顯微鏡下觀察融合蛋白在細胞內(nèi)的定位。研究結(jié)果:體外蛋白實驗發(fā)現(xiàn)兩個突變均降低了 γS-晶狀體蛋白的穩(wěn)定性,在高溫或者高濃度鹽酸胍環(huán)境下會促進蛋白的聚集。但是兩個蛋白對γS-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同:G75V突變一定程度上改變了γS-晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),明顯增加了蛋白的疏水面積,但在細胞實驗中未引起細胞內(nèi)的蛋白積聚;而G18D突變體并沒有明顯改變γS-晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu)或者三級結(jié)構(gòu),卻引起了細胞內(nèi)的蛋白聚集。研究結(jié)論:我們目前的研究表明G75V突變體改變了蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu),并顯著增加了蛋白的疏水面積,同時確定了野生型γS-野生型晶狀體蛋白的高穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)G75V和G18D突變體蛋白在熱變性以及胍變性下出現(xiàn)穩(wěn)定性的下降可能是先天性白內(nèi)障發(fā)生的主要原因。這兩個突變家系先證者表型主要為皮質(zhì)型白內(nèi)障,呈漸進性,突變患者白內(nèi)障在外界環(huán)境的壓力下出現(xiàn)逐漸加重的趨勢,與實驗結(jié)果相符。
【圖文】：

１．１．２晶狀體蛋白逡逑晶狀體蛋白是晶狀體中含量最多的蛋白，根據(jù)分子質(zhì)量的大小和結(jié)構(gòu)的差異逡逑可分為三種，ａ－晶狀體蛋白、ｐ－晶狀體蛋白和７－晶狀體蛋白。這三種晶狀體蛋白逡逑家族構(gòu)成了哺乳動物晶狀體中９０％的水溶性蛋白［１（）］。ａ－晶狀體蛋白單體具有一個逡逑ａ－晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在小熱休克蛋白家族中高度保守。在人晶狀體逡逑中，ａ－晶狀體蛋白以圓形聚集體的方式存在，大小約６００？９００ｋＤａ［Ｉ１］。ａＡ－和ａＢ－逡逑晶狀體蛋白可以在熱變性狀態(tài)下保護Ｐ－晶狀體蛋白、Ｙ－晶狀體蛋白和其他晶狀體逡逑中的蛋白質(zhì)［１２，１３］。ａ－晶狀體蛋白通過減少晶狀體內(nèi)隨著年齡增加而增加的部分變逡逑２逡逑

膠過濾層析技術(shù)逡逑過濾層析又稱為分子篩層析或體積排阻層析，是利用具有多孔分子篩作用，根據(jù)溶液中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小差異進行析技術(shù)［７７］。層析柱中填充的材料多為交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，該類狀結(jié)構(gòu)，當需分離的混合樣品在層析柱中隨洗脫液流動而發(fā)生質(zhì)由于體積相對較小，會通過凝膠中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進入顆粒內(nèi)部，經(jīng)過的流程較長，最后被洗脫出層析柱；而大分子物質(zhì)因為體粒內(nèi)部，直接沿凝膠顆粒間隙隨著洗脫液流動，所經(jīng)過的流較快，最快洗脫出層析柱；而中等大小的物質(zhì)則介于兩者之間，，析柱中洗脫出來。目前凝膠過濾層析技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、命大分子物質(zhì)的分離提純。下圖為凝膠過濾層析原理示意圖。逡逑上樣個分子邐洗脫邐洗股逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R776.1

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本文編號：2703132