【摘要】：研究目的:先天性白內(nèi)障是造成兒童視力損害的主要原因之一,其中有約四分之一的患者發(fā)病與遺傳相關(guān)。晶狀體蛋白是晶狀體最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,比重大約占晶狀體中水溶性蛋白的90%,其中γS-晶狀體蛋白又是重要的晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白之一,對長期維持晶狀體的屈光性和透明性有著重要作用。研究先天性白內(nèi)障發(fā)生的具體機(jī)制有助于從根源上透徹了解相關(guān)突變基因的具體功能和致病途徑,從而使得從基因或者蛋白質(zhì)層面徹底預(yù)防先天性白內(nèi)障的發(fā)生成為可能。目前關(guān)于γS-晶狀體蛋白突變致先天性白內(nèi)障的報道相對較少,對γS-晶狀體蛋白致先天性白內(nèi)障的具體機(jī)制研究也不夠深入,所以本研究選取浙二眼科中心最近發(fā)現(xiàn)的兩個已報道的γS-晶狀體蛋白突變(G75V和G18D),研究突變對γS-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響,從而更加深入了解γS-晶狀體蛋白突變致先天性白內(nèi)障的具體分子機(jī)制。研究方法:通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建.γS-晶狀體蛋白野生型和突變體的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a,轉(zhuǎn)化至Rosetta大腸桿菌中大量誘導(dǎo)表達(dá)野生型及突變體蛋白并純化;利用生物物理學(xué)方法,如圓二色光譜、熒光光譜等技術(shù)研究突變對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響。同時構(gòu)建γS-晶狀體蛋白野生型和突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1,轉(zhuǎn)染至人胚腎上皮細(xì)胞Hek293T中進(jìn)行過表達(dá),在共聚焦激光顯微鏡下觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。研究結(jié)果:體外蛋白實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個突變均降低了 γS-晶狀體蛋白的穩(wěn)定性,在高溫或者高濃度鹽酸胍環(huán)境下會促進(jìn)蛋白的聚集。但是兩個蛋白對γS-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同:G75V突變一定程度上改變了γS-晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),明顯增加了蛋白的疏水面積,但在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中未引起細(xì)胞內(nèi)的蛋白積聚;而G18D突變體并沒有明顯改變γS-晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu)或者三級結(jié)構(gòu),卻引起了細(xì)胞內(nèi)的蛋白聚集。研究結(jié)論:我們目前的研究表明G75V突變體改變了蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu),并顯著增加了蛋白的疏水面積,同時確定了野生型γS-野生型晶狀體蛋白的高穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)G75V和G18D突變體蛋白在熱變性以及胍變性下出現(xiàn)穩(wěn)定性的下降可能是先天性白內(nèi)障發(fā)生的主要原因。這兩個突變家系先證者表型主要為皮質(zhì)型白內(nèi)障,呈漸進(jìn)性,突變患者白內(nèi)障在外界環(huán)境的壓力下出現(xiàn)逐漸加重的趨勢,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
【圖文】：

１．１．２晶狀體蛋白逡逑晶狀體蛋白是晶狀體中含量最多的蛋白，根據(jù)分子質(zhì)量的大小和結(jié)構(gòu)的差異逡逑可分為三種，ａ－晶狀體蛋白、ｐ－晶狀體蛋白和７－晶狀體蛋白。這三種晶狀體蛋白逡逑家族構(gòu)成了哺乳動物晶狀體中９０％的水溶性蛋白［１（）］。ａ－晶狀體蛋白單體具有一個逡逑ａ－晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在小熱休克蛋白家族中高度保守。在人晶狀體逡逑中，ａ－晶狀體蛋白以圓形聚集體的方式存在，大小約６００？９００ｋＤａ［Ｉ１］。ａＡ－和ａＢ－逡逑晶狀體蛋白可以在熱變性狀態(tài)下保護(hù)Ｐ－晶狀體蛋白、Ｙ－晶狀體蛋白和其他晶狀體逡逑中的蛋白質(zhì)［１２，１３］。ａ－晶狀體蛋白通過減少晶狀體內(nèi)隨著年齡增加而增加的部分變逡逑２逡逑

膠過濾層析技術(shù)逡逑過濾層析又稱為分子篩層析或體積排阻層析，是利用具有多孔分子篩作用，根據(jù)溶液中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小差異進(jìn)行析技術(shù)［７７］。層析柱中填充的材料多為交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，該類狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)需分離的混合樣品在層析柱中隨洗脫液流動而發(fā)生質(zhì)由于體積相對較小，會通過凝膠中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)入顆粒內(nèi)部，經(jīng)過的流程較長，最后被洗脫出層析柱；而大分子物質(zhì)因?yàn)轶w粒內(nèi)部，直接沿凝膠顆粒間隙隨著洗脫液流動，所經(jīng)過的流較快，最快洗脫出層析柱；而中等大小的物質(zhì)則介于兩者之間，，析柱中洗脫出來。目前凝膠過濾層析技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、命大分子物質(zhì)的分離提純。下圖為凝膠過濾層析原理示意圖。逡逑上樣個分子邐洗脫邐洗股逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R776.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉冬梅;周姝;陳捷敏;彭書雅;夏文濤;;αB晶狀體蛋白在視網(wǎng)膜及眼外組織器官中表達(dá)及其作用機(jī)制[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2014年06期

2 劉平;蘇勝;;白內(nèi)障蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀及未來研究方向[J];眼科新進(jìn)展;2014年01期

3 屈凌寒;韓笑;劉閣;嚴(yán)宏;;α-晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及基因?qū)W研究進(jìn)展[J];國際眼科雜志;2012年07期

4 任秋君;高前進(jìn);單勁松;馮國群;;大強(qiáng)度離心運(yùn)動后骨骼肌αB-晶狀體蛋白的表達(dá)特征研究[J];北京體育大學(xué)學(xué)報;2011年09期

5 汪臘一;侯世科;吳志鴻;;αB晶狀體蛋白在晶狀體外的研究概況[J];東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年05期

6 李琪;嚴(yán)宏;;α-晶狀體蛋白在眼科疾病中的作用研究進(jìn)展[J];眼科研究;2010年11期

7 劉樹柏;何英英;錢金橋;李文輝;張?jiān)?;非晶狀體βγ-晶狀體蛋白的研究進(jìn)展[J];動物學(xué)研究;2008年06期

8 劉康,王一;α晶狀體蛋白的研究進(jìn)展[J];眼科新進(jìn)展;2005年02期

9 嚴(yán)宏,惠延年,李明勇,張延鳳,張曉楠,武麗華;α-晶狀體蛋白分子伴娘功能的初步研究[J];中華眼科雜志;2004年08期

10 嚴(yán)宏,俞蘭,范建國;糖基化對牛α-晶狀體蛋白分子伴娘功能的作用[J];中華眼科雜志;2004年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韋佳辰;杜睿琪;沈志強(qiáng);宋凡;;晶狀體蛋白液-液相分離及逾滲相變的分子動力學(xué)模擬研究[A];中國力學(xué)大會-2015論文摘要集[C];2015年

2 王文軍;唐羅生;;不同生長期晶狀體蛋白對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的影響[A];中國眼底病論壇·全國眼底病專題學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2008年

3 王凱軍;姚克;;不同強(qiáng)度微波輻射對體外培養(yǎng)兔晶狀體蛋白成分的影響[A];2006年浙江省眼科學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

4 王沙;席藝博;閆永彬;;pA3/1-晶狀體蛋白的蛋白酶活性研究[A];第十屆全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2011年

5 劉康;王一;王艷華;牛建軍;曾玉曉;;α晶狀體蛋白促大鼠RGCs存活和突起生長的體外研究[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)會議暨學(xué)會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

6 陳強(qiáng);宋貴波;楊娜;劉媛媛;鄭芳;;αB-晶體蛋白R11H突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的分子機(jī)制研究[A];第八次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議(中華醫(yī)學(xué)會2009年醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)年會)論文摘要匯編[C];2009年

7 王凱軍;;rD-晶狀體蛋白突變致特殊表型先天性白內(nèi)障的動物實(shí)驗(yàn)研究[A];2007年浙江省眼科學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

8 鄭芳;劉媛媛;陳強(qiáng);饒艷;EMILY;;三例遺傳性白內(nèi)障家系的分子診斷[A];第八次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議(中華醫(yī)學(xué)會2009年醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)年會)論文摘要匯編[C];2009年

9 陳強(qiáng);馬俊婕;宋貴波;鄭芳;;遺傳性白內(nèi)障致病基因的篩查及其相關(guān)功能的研究[A];第四屆全國血脂分析與臨床學(xué)術(shù)研討會暨第九屆全國脂蛋白學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

10 陳強(qiáng);馬俊婕;宋貴波;劉媛媛;楊娜;鄭芳;;先天性白內(nèi)障致病基因的篩查及其生物信息學(xué)分析[A];第八次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議(中華醫(yī)學(xué)會2009年醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)年會)論文摘要匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 劉永平邋鄭義;我國白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理研究獲重大進(jìn)展[N];中國醫(yī)藥報;2008年

2 記者 張家偉;白內(nèi)障或?qū)⒂兴幙芍蝃N];健康報;2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 朱莎;γS-晶狀體蛋白突變致先天性白內(nèi)障的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

2 應(yīng)希;α晶狀體蛋白對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

3 徐偉珍;常染色體顯性遺傳“珊瑚狀”核性白內(nèi)障的分子遺傳學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2004年

4 齊艷秀;丙酮酸對大鼠糖尿病性白內(nèi)障抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

5 劉雙;αB-晶狀體蛋白抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2005年

6 季櫻紅;先天性遺傳性白內(nèi)障的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

7 王文軍;不同生長期晶狀體蛋白對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的促進(jìn)作用及機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2008年

8 張新彥;年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體蛋白磷酸化位點(diǎn)鑒定[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

9 席藝博;β/γ晶狀體蛋白C端結(jié)構(gòu)域遺傳突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的分子機(jī)理研究[D];蘭州大學(xué);2014年

10 高茜;βγ-晶狀體蛋白與三葉因子復(fù)合物生物化學(xué)特性與作用機(jī)制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 沈志偉;硅油對晶狀體蛋白體外積聚性影響研究[D];中國科學(xué)院研究生院(上海應(yīng)用物理研究所);2017年

2 劉志濤;αB-晶狀體蛋白在不同周齡正常大鼠晶狀體中的表達(dá)[D];吉林大學(xué);2012年

3 唐德榮;αB晶狀體蛋白促進(jìn)體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

4 張燦偉;a晶狀體蛋白抗體與超聲乳化術(shù)后前房炎癥反應(yīng)相關(guān)性的研究[D];濱州醫(yī)學(xué)院;2013年

5 邱斌;α晶狀體蛋白分子伴侶對實(shí)驗(yàn)性白內(nèi)障作用及干預(yù)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

6 周鐘強(qiáng);兔增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

7 汪臘一;αB-晶狀體蛋白對大鼠急性高眼壓后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活及凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2011年

8 曾琨;一個先天性核性白內(nèi)障家族的γ晶狀體蛋白基因篩查[D];暨南大學(xué);2005年

9 劉冬梅;大鼠甲醇中毒后視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)及αB晶狀體蛋白、ALDH2和ATP5A1的變化及相關(guān)性[D];蘇州大學(xué);2015年

10 李謹(jǐn)予;后極性表型先天性白內(nèi)障的疾病相關(guān)候選基因定位[D];浙江大學(xué);2011年

本文編號：2703132