發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 03:28

【摘要】：目的:構(gòu)建DC-SIGNR(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin-related protein,樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子3非整合素因子相關(guān)蛋白)慢病毒表達(dá)載體,設(shè)計(jì)EBV直接感染及淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)間接感染兩種模式,探討DC-SIGNR是否具有促進(jìn)EBV感染上皮細(xì)胞的作用,為進(jìn)一步探討EBV感染鼻咽上皮細(xì)胞的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1、制備EBV顆粒:通過胃腺癌細(xì)胞AGS-EBV-GFP制備EBV-GFP;2、EBV顆粒與淋巴瘤KMH2細(xì)胞直接接觸培養(yǎng),用熒光顯微鏡觀察;3、EBV顆粒與候選的NPC細(xì)胞和鼻咽部永生化上皮細(xì)胞直接接觸感染模式:用制備的EBV顆粒直接與各靶細(xì)胞包括HONE1、HK1、CNE1、NP69接觸感染,后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NPC細(xì)胞中EBV相關(guān)分子EBER、EBNA1、LMP1、LMP2A表達(dá)量;4、構(gòu)建慢病毒DC-SIGNR過表達(dá)載體,上調(diào)其在NPC細(xì)胞HONE1及鼻咽部永生化上皮細(xì)胞株NP69上的表達(dá),EBV顆粒直接感染,用RTFQ PCR檢測細(xì)胞中EBV相關(guān)分子EBER、EBNA1、LMP1、LMP2A表達(dá)量;檢測其是否具有直接促進(jìn)EBV感染的作用;5、構(gòu)建慢病毒DC-SIGNR過表達(dá)載體上調(diào)DC-SIGNR在RAJI細(xì)胞中的表達(dá):通過RAJI-DC-SIGNR及RAJI-CONTROL細(xì)胞模型與NPC細(xì)胞、正常鼻咽部上皮永生化細(xì)胞共培養(yǎng)間接感染模式,共培養(yǎng)48h后,經(jīng)抗體激活補(bǔ)體依賴的殺傷實(shí)驗(yàn)去除共培養(yǎng)RAJI細(xì)胞,用RTFQ PCR和Western Blot檢測EBV相關(guān)分子及其表達(dá)量。結(jié)果:1、熒光顯微鏡視野下觀察淋巴瘤KMH2細(xì)胞與EBV懸液直接接觸培養(yǎng)后,使原本不具有綠色熒光的KMH2具有綠色熒光。成功制備具有感染能力的EB病毒顆粒。2、成功構(gòu)建DC-SIGNR過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞系通過測序結(jié)果驗(yàn)證,證明DC-SIGNR慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。3、上調(diào)DC-SIGNR表達(dá)前后的各種NPC細(xì)胞及鼻咽部永生化細(xì)胞系NP69與EB病毒顆粒直接接觸培養(yǎng)后,未觀察到EBV感染的綠色熒光。同時(shí)RTFQ PCR結(jié)果顯示,其EBV相關(guān)分子(EBER、EBNA1、LMP2A、LMP1)表達(dá)亦基本無法檢出。4、上調(diào)RAJI細(xì)胞中DC-SIGNR的表達(dá)(RAJI-DC-SIGNR)與對照組(RAJI-CONTROL)相比明顯增強(qiáng)EBV感染NPC細(xì)胞后相關(guān)分子的表達(dá),但是確仍然無法提高EBV感染NP69的效率。(1)與RAJI-DC-SIGNR共培養(yǎng)后HONE1的EBV相關(guān)分子m RNA相對表達(dá)量(2-△△Ct)結(jié)果顯示:EBER(3.42±0.11)和EBNA1(3.21±0.84)較與RAJI-CONTROL(陰性對照組)共培養(yǎng)后的EBER(1.24±0.27)和EBNA1(1.56±0.49)表達(dá)量均顯著升高,p值分別為0.002和0.0432。而LMP1(1.05±0.30vs1.37±0.52)和LMP2A(1.20±0.11 vs1.12±0.12)的相對含量(2-△△Ct)兩組未見顯著差別,p值分別為0.4119和0.4588。(2)與RAJI-DC-SIGNR共培養(yǎng)后的HK1的EBER(75.46±10.43)、EBNA1(1.45±0.18)、LMP1(7.38±3.58)、LMP2A(5.68±1.67)較與RAJI-CONTROL(陰性對照組)共培養(yǎng)后的EBER(1.52±0.46)、EBNA1(1.05±0.05)、LMP1(1.20±0.22)、LMP2A(1.09±0.08)表達(dá)量均顯著升高,p值分別為0.003、0.0203、0.0407和0.0090。(3)與RAJI-DC-SIGNR共培養(yǎng)后的CNE1的EBER(6.82±1.14)、EBNA1(4.62±1.77)、LMP1(12.27±1.70)較RAJI-CONTROL(陰性對照組)共培養(yǎng)后的EBER(1.12±0.10)、EBNA1(1.46±0.50)、LMP1 m RNA(2.08±0.94)表達(dá)量均顯著升高升高,p值分別為0.0010、0.0401和0.0008。而LMP2A(0.99±0.49 vs 0.67±0.31)的相對含量未見顯著差別,p值為0.3938。5、Western-blot結(jié)果顯示,各NPC細(xì)胞株與RAJI-DC-SIGNR共培養(yǎng)后,表達(dá)的EBNA1蛋白量顯著高于與RAJI-CONROL(陰性對照組)共培養(yǎng)后的表達(dá)量。其中與RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培養(yǎng)48h后的HONE1細(xì)胞株EBNA1蛋白表達(dá)量,其灰度值依次計(jì)算為0.36±0.05、0.22±0.05,差別顯著(P=0.0267)。與RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培養(yǎng)48h后的HK1細(xì)胞株EBNA1蛋白表達(dá)量,其灰度值依次計(jì)算為0.46±0.01、0.41±0.00,兩者差別有顯著意義(P=0.0020)。RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培養(yǎng)48h后的CNE1細(xì)胞株EBNA1蛋白表達(dá)量,其灰度值依次計(jì)算為0.50±0.04、0.45±0.04,兩者差別無顯著意義(P=0.2168)。RAJI-DC-SIGNR共培養(yǎng)后的HONE1、HK1、CNE1中EBNA1蛋白表達(dá)量明顯高于空載慢病毒感染的RAJI-CONTROL(陰性對照組),P分別為0.0267、0.0020和0.2168。6、鼻咽部永生化上皮細(xì)胞系NP69在上調(diào)DC-SIGNR前后無論是與EB病毒顆粒直接感染模式還是淋巴瘤RAJI細(xì)胞共培養(yǎng)間接感染模式,實(shí)時(shí)熒光定量PCR均未能發(fā)現(xiàn)EBER、EBNA1、LMP2A、LMP1 m RNA表達(dá)量明顯改變。結(jié)論:1、在體外模型實(shí)驗(yàn)中,EBV懸液可能較難直接感染鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽部上皮細(xì)胞。2、EBV可能主要以細(xì)胞與細(xì)胞間間接接觸的間接模式感染鼻咽癌細(xì)胞。3、DC-SIGNR在細(xì)胞與細(xì)胞間間接接觸模式下能夠提高鼻咽癌細(xì)胞EBV感染效率,其不是鼻咽癌細(xì)胞表面EBV直接受體,而是可能作為間接受體促進(jìn)EBV的感染。4、在體外模型實(shí)驗(yàn)中,在直接模式或細(xì)胞與細(xì)胞接觸間接模式中正常鼻咽部正常永生化上皮細(xì)胞可能較難感染上EBV。
【圖文】：

備的EBV病毒懸液使用RTFQ PCR（TaqMan 探量。：TaqMan 探針法是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（滅物質(zhì)（如：TAMRA等）的TaqMan 探針進(jìn)行完整時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)TaqMan 探針被分解后，，5’端的熒光物質(zhì)便會CR反應(yīng)液中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火版雜交。在進(jìn)一步PCR反應(yīng)的延伸過程中，TaqD板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通度，達(dá)到PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

圖 2 慢病毒感染目的基因的 ORFFigure 2 The ORF of the target gene of lentivirus infec病毒序列：95-Lv105 （7 重復(fù)）GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGATTCGAAGAACACAAAAAAGCAGGCTTGGAAGGAGTTCGAACCATGAGTGACTCCAAGGAACCAGCAGCTGGGCCTCCTGGAAGAAGATCCAACAACCAGTGGCATCAGACTTTTTCTTTCAATTCCAGCAGATACATGGCCACAAGAGCTCTACAGGGTGTCTTGGC
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63

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本文編號：2652359