【摘要】：目的通過行兔眼白內(nèi)障囊外摘除術(shù)建立后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO)的動物模型,檢測房水中Dkk1(Dickkopf-1)及Wnt3a的含量,觀察囊外摘除術(shù)后加入Dkk1組與對照組細(xì)胞遷移及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生情況,研究Dkk1對于Wnt3a誘導(dǎo)的EMT及細(xì)胞遷移的的影響并探索可能的細(xì)胞機(jī)制。尋求新的有效抑制PCO的靶點(diǎn),力求為白內(nèi)障術(shù)后PCO的發(fā)生提供更好的防治方案。方法選取新西蘭大耳白兔24只,術(shù)前抽取右眼房水檢測其Wnt3a和Dkk1的濃度,右眼行白內(nèi)障囊外摘除手術(shù),術(shù)后兔子被隨機(jī)分為兩組(每組12只),即磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)處理組和Dkk1治療組。將大約1ml Dkk1(30ng/ml)或1ml PBS分別注射到右眼的前房中。在手術(shù)后第十四天,抽取右眼房水檢測Wnt3a和Dkk1的濃度。摘除左眼和右眼,均使用福爾馬林固定,石蠟包埋,并行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),免疫組化(immunohistochmeistry,IHC)染色,蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot,WB),免疫熒光,細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果手術(shù)后第14天,大多數(shù)用PBS治療的右眼出現(xiàn)致密纖維化或明顯的上皮混濁,用Dkk1治療的右眼后囊顯示輕度混濁。IHC結(jié)果表明,手術(shù)后14天,用PBS處理的右眼顯示出與PCO相關(guān)的幾個特征,包括后囊中央明顯的細(xì)胞增殖和顯著的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)核轉(zhuǎn)移。Dkk1治療組與PBS治療組相比,右眼后囊膜β-catenin核轉(zhuǎn)移較少(32.8±6.2%vs.9.2±3.1%,P0.05)。酶聯(lián)免疫吸附測定法顯示,結(jié)果顯示,加入PBS處理后,右眼前房內(nèi)Wnt3a的平均濃度為173.8 pg/ml,平均Dkk1濃度為35.0 pg/ml。WB和免疫熒光染色分析,Wnt3a轉(zhuǎn)染的人晶狀體上皮細(xì)胞系(HLE-B3)細(xì)胞中誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白的含量下降,纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的含量增加。然而,在Wnt3a過表達(dá)的細(xì)胞中加入Dkk1,檢測到HLE-B3細(xì)胞中E-鈣粘蛋白表達(dá)增加,纖連蛋白表達(dá)降低。此外免疫熒光還顯示:Wnt/β-catenin信號通路參與了EMT和LEC遷移,而Dkk1通過抑制β-catenin的核積累抑制了EMT和細(xì)胞遷移。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a在HLE-B3細(xì)胞中引起明顯的水平和垂直遷移。而Dkk1能夠阻斷Wnt3a誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞遷移。Transwell遷移實(shí)驗(yàn):與對照組相比,Wnt3a過表達(dá)的HLE-B3細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)最多,而加入Dkk1的Wnt3a過表達(dá)的HLE-B3細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少。明膠酶譜結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a顯著增加了應(yīng)力纖維的數(shù)量,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-1的表達(dá)以及MMP-2和MMP-9的活性。相比之下,Dkk1處理顯著減少應(yīng)力纖維的量并抑制Wnt3a誘導(dǎo)的MMP-1表達(dá)和MMP-2和MMP-9活性的增加。結(jié)論1.Dkk1抑制兔PCO模型中的PCO形成。2.Dkk1逆轉(zhuǎn)了Wnt3a過表達(dá)的HLE-B3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。3.Dkk1抑制Wnt3a過表達(dá)的HLE-B3細(xì)胞的遷移。4.Dkk1抑制HLE-B3細(xì)胞中Wnt3a誘導(dǎo)的β-catenin核轉(zhuǎn)移。5.Dkk1抑制Wnt3a過表達(dá)的HLE-B3細(xì)胞中細(xì)胞骨架合成、MMP1的表達(dá)、MMP-2和MMP-9的活性。
【圖文】：

圖 1 Dkk1 抑制家兔 PCO 模型中的 PCO 形成。術(shù)后 14 天，PBS 治療的右眼明顯的后囊膜混濁，Dkk1 治療的右眼后顯示輕度混濁。圖 2 術(shù)后 14 天，，用 PBS 或 Dkk1 的處理，發(fā)生細(xì)胞沿右眼后囊遷移，α-SMA 表達(dá)增強(qiáng)，具

12內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文（2018）Wnt/β-catenin 通路干擾的結(jié)果。圖 1 Dkk1 抑制家兔 PCO 模型中的 PCO 形成。術(shù)后 14 天，PBS 治療的右眼明顯的后囊膜混濁，Dkk1 治療的右眼后顯示輕度混濁。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R779.6

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本文編號：2644326