【摘要】：目的:本課題在臨床研究部分,篩選糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者血清特異性microRNA(miRNA);在體內(nèi)實驗研究部分,檢測糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中候選miRNA及其靶基因的表達;在體外實驗研究部分,驗證高糖處理的人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)中候選miRNA對其靶基因的靶向調(diào)控作用,目的旨在探討血清miRNA可能成為DR潛在的發(fā)生預警、診斷分期和預后評估的生物標志物奠定理論基礎。方法:在臨床研究部分,使用miRNA微陣列芯片分析,篩選DR患者血清特異性miRNA表達譜;使用維恩圖分析,確定DR患者血清特異性miRNA表達譜中的候選miRNA;使用實時定量PCR(qPCR),檢測DR患者血清候選miRNA的表達水平;使用ROC曲線,評估血清候選miRNA對DR患者的診斷效能;使用生物信息學分析,預測DR患者血清候選miRNA的靶基因及其生物學功能和信號傳導通路。在體內(nèi)實驗研究部分,使用二磷酸腺苷酶(ADPase)染色,觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學特征;使用蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織學特征;使用qPCR,在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中檢測候選miRNA及其靶基因mRNA的表達水平;使用蛋白質(zhì)免疫印跡法,在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中檢測候選miRNA靶基因蛋白的表達水平。在體外實驗研究部分,使用雙熒光素酶報告系統(tǒng),驗證候選miRNA及其靶基因的靶向結合作用;使用細胞活性檢測試劑盒(CCK-8),在高糖環(huán)境中檢測候選miRNA對HUVEC細胞活力的影響;使用流式細胞儀,在高糖環(huán)境中檢測候選miRNA對HUVEC細胞凋亡的影響;使用qPCR,在高糖環(huán)境中檢測HUVEC中候選miRNA對其靶基因mRNA表達的影響;使用蛋白質(zhì)免疫印跡法,在高糖環(huán)境中檢測HUVEC中候選miRNA對其靶基因蛋白表達的影響。結果:在臨床研究部分,miRNA微陣列芯片分析表明,在DR患者血清中存在特異性miRNA表達譜;維恩圖分析表明,在DR患者血清特異性miRNA表達譜中可以確定4個候選miRNA,其中表達上調(diào)的包括miR-18b、miR-19b和miR-211,而表達下調(diào)的包括miR-23a;qPCR表明,血清miR-18b、miR-19b和miR-211的表達趨勢與血清miRNA表達譜中的表達趨勢一致,而血清miR-23a的表達趨勢與血清miRNA表達譜中的表達趨勢不一致;ROC曲線表明,血清miR-18b、miR-19b和miR-211對DR均有診斷效能,其中miR-211診斷效能最高,而血清miR-23a對DR沒有診斷效能;生物信息學分析表明,miR-18b、miR-19b和miR-211共預測得到2081個靶基因,其中沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同系物1(SIRT1)可能作為miR-211的一個靶基因;候選miRNA的靶基因參與的生物過程包括基于DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)和基于DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等,細胞組成包括細胞質(zhì)、細胞核和細胞質(zhì)膜等,分子功能包括蛋白質(zhì)結合、金屬離子結合和DNA結合等;候選miRNA的靶基因參與的信號通路包括軸突導向通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導通路和內(nèi)噬作用通路等。在體內(nèi)實驗研究部分,ADPase染色表明,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜新生血管密度顯著增加,并且隨著糖尿病病程的延長逐漸加重;HE染色表明,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜細胞核計數(shù)顯著增加,并且隨著糖尿病病程的延長逐漸加重;qPCR表明,miR-211在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達顯著上調(diào),并且隨著糖尿病病程的延長表達逐漸增加,而SIRT1 mRNA在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達顯著下調(diào),并且隨著糖尿病病程的延長表達逐漸減少;蛋白質(zhì)免疫印跡法表明,SIRT1蛋白在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達顯著下調(diào),并且隨著糖尿病病程的延長表達逐漸減少。在體外實驗研究部分,雙熒光素酶報告系統(tǒng)表明,miR-211及其靶基因SIRT1存在靶向結合作用;CCK-8表明,在高糖環(huán)境中轉(zhuǎn)染antagomiR-211的HUVEC細胞活力顯著上升;流式細胞儀表明,在高糖環(huán)境中轉(zhuǎn)染antagomiR-211的HUVEC細胞凋亡顯著下降;qPCR表明,在高糖環(huán)境中轉(zhuǎn)染antagomiR-211的HUVEC SIRT1 mRNA表達顯著上調(diào);蛋白質(zhì)免疫印跡法表明,在高糖環(huán)境中轉(zhuǎn)染antagomiR-211的HUVEC中SIRT1蛋白表達顯著上調(diào)。結論:此次臨床和實驗研究表明,DR患者血清中存在特異性miRNA表達譜;血清miR-211可能作為一個新的具有高度敏感性和特異性的生物標志物,并且通過靶向調(diào)控SIRT1影響DR的發(fā)生和發(fā)展。
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中國醫(yī)科大學博士學位論文3.2 miRNA 芯片檢測結果使用 miRNA 芯片檢測血清 miRNA 表達譜（圖 1）。結果表明，HC 組對比 NDR組，共 38 個表達顯著失調(diào)的 miRNA，其中 24 個 miRNA 表達上調(diào)，14 個 miRNA表達下調(diào)；HC 組對比 DR 組，，共 45 個表達顯著失調(diào)的 miRNA，其中 22 個 miRNA表達上調(diào)，23 個 miRNA 表達下調(diào)；NDR 組對比 DR 組，共 40 個表達顯著失調(diào)的miRNA，其中 24 個 miRNA 表達上調(diào)，16 個 miRNA 表達下調(diào)。

23 個 miRNA 表達下調(diào)；NDR 組對比 DR 組，共 40 個表達顯著失調(diào)的miRNA，其中 24 個 miRNA 表達上調(diào)，16 個 miRNA 表達下調(diào)。圖 1 血清 miRNA 表達譜中表達失調(diào)的 miRNA使用火山圖分析血清 miRNA 表達譜（圖 2）。橫坐標表示兩組間差異倍數(shù)，縱坐標表示 P 值，兩條垂直線分別代表差異倍數(shù)上調(diào) 2.0 倍及下調(diào) 0.5 倍，水平線對應 P = 0.05。結果表明，紅點代表特異性表達上調(diào)的 miRNA，綠點代表特異性表達下調(diào)的 miRNA。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R774.1

【參考文獻】

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1 劉鶴南;李迅;濮偉;陸巖;陳曉隆;;手術前玻璃體腔注射bevacizumab對增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變玻璃體切除術影響的Meta分析[J];中國醫(yī)科大學學報;2012年09期

2 劉鶴南;李迅;濮偉;陸巖;陳曉隆;;手術前玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體bevacizumab預防增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變玻璃體切割手術后玻璃體積血的meta分析[J];中華眼底病雜志;2012年03期

3 劉鶴南;朱穎;陳曉隆;陸巖;;腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻滯劑預防早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變研究[J];中華眼底病雜志;2010年03期

本文編號：2643426