【摘要】：目的:研究在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus,AF)性角膜炎中JNK的磷酸化在Dectin-1介導(dǎo)的IL-1β生成中的作用以及Dectin-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。方法:1.采用基質(zhì)內(nèi)注射的方法建立12h、1d、2d小鼠煙曲霉菌性角膜炎動(dòng)物模型,采用PCR、Western Bolt對(duì)Dectin-1和IL-1β的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè),采用免疫熒光對(duì)Dectin-1的蛋白表達(dá)進(jìn)行定位檢測(cè)。2.Dectin-1 siRNA對(duì)小鼠角膜進(jìn)行預(yù)處理,建立小鼠煙曲霉菌性角膜炎動(dòng)物模型,裂隙燈下觀察小鼠角膜炎癥反應(yīng)情況并記錄臨床評(píng)分,PCR或Western Bolt檢測(cè)Dectin-1、JNK、p-JNK、IL-1β表達(dá)。3.JNK抑制劑SP600125對(duì)小鼠角膜和THP-1巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,建立煙曲霉菌感染模型之后,PCR、Western Bolt對(duì)IL-1β的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。4.Dectin-1 siRNA對(duì)小鼠角膜進(jìn)行預(yù)處理,建立小鼠煙曲霉菌性角膜炎動(dòng)物模型。PCR、Western Bolt對(duì)Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c(cytochrome-c,cyt-c)、caspase-8、caspase-9、caspase-3進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.與正常對(duì)照組相比,Dectin-1 mRNA在煙曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表達(dá)明顯升高,Dectin-1蛋白在煙曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.05)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表達(dá)明顯升高。IL-1βmRNA在煙曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表達(dá)明顯升高。IL-1β蛋白在煙曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表達(dá)逐漸升高。2.Dectin-1 siRNA對(duì)小鼠角膜進(jìn)行預(yù)處理,建立小鼠煙曲霉菌性角膜炎動(dòng)物模型后,與對(duì)照siRNA+AF組相比,Dectin-1 siRNA+AF組小鼠角膜炎癥反應(yīng)減輕,臨床評(píng)分降低(p0.05),JNK的磷酸化減少(p0.001),IL-1β的表達(dá)在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上顯著降低。3.SP600125預(yù)處理小鼠角膜和THP-1巨噬細(xì)胞后建立煙曲霉菌感染模型。在動(dòng)物模型中,SP600125+AF組與DMSO+AF組相比,IL-1β在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表達(dá)明顯降低。在細(xì)胞模型中,SP600125+AF組與DMSO+AF組相比,IL-1β在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表達(dá)明顯降低。4.Dectin-1 si RNA對(duì)小鼠角膜進(jìn)行預(yù)處理,建立小鼠煙曲霉菌性角膜炎動(dòng)物模型后,Dectin-1 siRNA+AF組與對(duì)照siRNA+AF組相比,Dectin-1干擾并未明顯影響caspase-8 mRNA表達(dá)(P0.05)和cleaved-caspase-8蛋白表達(dá)(P0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Bcl-2在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表達(dá)下降;而Bax(p0.001)、cyt-c(p0.05)、caspase-9(p0.001)、caspase-3(p0.001)在mRNA水平上的表達(dá)上升,Bax(p0.001)、cyt-c(p0.001)、cleaved-caspase-9(p0.001)、cleaved-caspase-3(p0.001)在蛋白水平上的表達(dá)上升。結(jié)論:小鼠煙曲霉菌性角膜炎中Dectin-1調(diào)控JNK的磷酸化和IL-1β的產(chǎn)生,磷酸化的JNK誘導(dǎo)IL-1β的生成。Dectin-1通過線粒體途徑抑制小鼠煙曲霉菌性角膜炎中細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

結(jié)果結(jié) 果2.1 煙曲霉菌菌絲及分生孢子形態(tài)觀察將煙曲霉菌接種于 Sabouroud 固體培養(yǎng)基中，再置于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-2 天后可見白色真菌菌落形成，呈棉花樣。隨著真菌菌落的不斷生長(zhǎng)以及分生孢子的不斷產(chǎn)生，培養(yǎng)基中的煙曲霉菌呈灰綠色，粉末狀（圖 1.A）。收集培養(yǎng) 2-3 天的煙曲霉菌的分生孢子之后用 PBS 涂片鏡檢，可見煙曲霉菌分生孢子呈球形，布滿整個(gè)視野（圖 1.B）。

圖 2.（A-H）小鼠煙曲霉菌性角膜炎中 Dectin-1 和 IL-1β的表達(dá)情況。（A）和（C） 為小鼠角膜感染煙曲霉菌后 Dectin-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)情況；（B）和（D）為 IL-1β的表達(dá)情況；（E-H）是對(duì) Dectin-1 進(jìn)行免疫熒光染色，紅色的代表 Dectin-1，藍(lán)色的代表 DAPI。2.3 干擾 Dectin-1 后可減輕小鼠煙曲霉菌性角膜炎炎癥反應(yīng)為了確定 Dectin-1 對(duì)小鼠煙曲霉菌性角膜炎炎癥反應(yīng)的影響，我們用 Dectin-1siRNA 特異性地對(duì)小鼠角膜中 Dectin-1 進(jìn)行干擾，并通過臨床評(píng)分和裂隙燈顯微鏡檢查證實(shí)了特異性干擾了 Dectin-1 之后可減輕小鼠煙曲霉菌性角膜炎炎癥反應(yīng)。角膜照片顯示，與對(duì)照 siRNA + AF 組（圖 3.A）相比，Dectin-1 siRNA + AF 組（圖3.B）的小鼠角膜感染較輕，角膜浸潤(rùn)灶較小，角膜潰瘍的面積較小，潰瘍深度較淺。兩組間臨床評(píng)分的結(jié)果也顯示出顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 3.C），，與裂隙燈下所見一致，Dectin-1 siRNA 干預(yù)組的臨床評(píng)分較 siRNA 對(duì)照組明顯降低。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R772.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 Cheng-Cheng Zhu;Gui-Qiu Zhao;Jing Lin;Li-Ting Hu;Qiang Xu;Xu-Dong Peng;Xue Wang;Sheng Qiu;;Dectin-1 agonist curdlan modulates innate immunity to Aspergillus fumigatus in human corneal epithelial cells[J];International Journal of Ophthalmology;2015年04期

本文編號(hào)：2620121