本文關(guān)鍵詞：醛糖還原酶基因缺失誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷后巨噬細(xì)胞向M2方向極化并促進(jìn)視神經(jīng)功能恢復(fù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動(dòng)物周?chē)窠?jīng)（peripheral nervous system, PNS)有較強(qiáng)的再生能力，而中樞神經(jīng)（central nervous system, CNS)損傷后幾乎不能再生[1,2]，同樣，屬于中樞神經(jīng)的視神經(jīng)受損傷后不能再生并造成視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的不可逆損傷，導(dǎo)致視力喪失。醛糖還原酶（aldose reductase, AR）屬于醛酮還原酶超家族，是葡萄糖多元醇通路中重要的限速酶[3]，最近的一系列研究顯示AR在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[4,5]，在神經(jīng)再生領(lǐng)域上目前比較關(guān)注巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可以極化為M1和M2兩種細(xì)胞亞群，，M2細(xì)胞可以移除一些抑制軸突生長(zhǎng)的物質(zhì)如髓鞘相關(guān)蛋白從而促進(jìn)視神經(jīng)再生[6-8]。本課題組前期研究，在小鼠脊髓損傷模型中（Spinal Cord Injury, SCI），AR基因敲除后可以減少脊髓損傷面積并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)以AR為重點(diǎn)研究對(duì)象，旨在觀察小鼠視神經(jīng)夾傷（optic nervecrush, ONC）后醛糖還原酶（AR）對(duì)視神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的影響及可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)有二部分組成： 實(shí)驗(yàn)一建立ONC模型并觀察ONC后AR在視神經(jīng)的表達(dá)情況。建立視神經(jīng)夾傷模型（ONC），野生型小鼠（C57BL/6-AR+/+）分兩組，一組為假手術(shù)組，假手術(shù)組僅暴露視神經(jīng)，一組為夾傷組模型，時(shí)間點(diǎn)為0d、3d、5d、7d、14d,利用westernblot、QPCR檢測(cè)假手術(shù)組和夾傷組的AR蛋白表達(dá)變化情況。建立野生型小鼠和AR基因敲除型小鼠的視神經(jīng)夾傷模型，選取術(shù)前4天行視覺(jué)電生理F-VEP檢查并為對(duì)照組，ONC后選3d、7d和14d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)行F-VEP檢查，旨在觀察每組夾傷前后視神經(jīng)傳導(dǎo)功能，鑒定ONC模型可靠性，并比較兩組小鼠相同時(shí)間點(diǎn)的視神經(jīng)傳導(dǎo)功能。 實(shí)驗(yàn)二觀察ONC后，AR對(duì)視神經(jīng)再生和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活影響及可能的分子機(jī)制。首先應(yīng)用野生型小鼠與YFP小鼠交配獲得的AR+/+-Thy1-YFP小鼠，同樣方法用AR敲除小鼠（AR-/-）和YFP小鼠交配獲得AR-/--Thy1-YFP小鼠，建立視神經(jīng)夾傷模型，夾傷后選取3d、7d、14d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)和假手術(shù)組（CON）的眼球，冰凍切片利用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)假手術(shù)組和3d、7d、14d存活的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目，并比較同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠存活的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目。為了檢驗(yàn)兩種小鼠視神經(jīng)的再生情況，小鼠玻璃體內(nèi)注射綠色熒光標(biāo)記的霍亂毒素B（Cholera Toxinsubunit, CTB），可以順行標(biāo)記再生的視神經(jīng)纖維，ONC后，處死前4天注射CTB，7d取材，冰凍切片后可直接在熒光顯微鏡下觀察再生的神經(jīng)纖維[9]。ONC后，7d收集夾傷的視神經(jīng)，利用免疫熒光組織化學(xué)觀察活化的巨噬細(xì)胞。ONC后，利用western blot法檢測(cè)iNOS（M1標(biāo)志性分子）和Arg1（M2標(biāo)志性分子）的表達(dá)變化,觀察野生型小鼠和AR敲除小鼠0d、3d、5d、7d、14d, iNOS和Arg1的表達(dá)變化。 第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果， western blot法檢測(cè)假手術(shù)組和ONC組0d、3d、5d、7d、14d視神經(jīng)上AR的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：假手術(shù)組AR表達(dá)幾乎無(wú)變化，ONC后隨著時(shí)間延長(zhǎng)AR表達(dá)增高，且第5天達(dá)到高峰，QPCR與上述趨勢(shì)基本一致。ONC后兩種小鼠F-VEP P1峰時(shí)值隨時(shí)間延長(zhǎng)而延長(zhǎng)，在第3d、7d、14d時(shí)AR敲除小鼠P1峰時(shí)值明顯短于野生型小鼠，在ONC后第3d、7d、14d，F(xiàn)-VEP P1波幅明顯低于術(shù)前水平，且在第7d、14d時(shí)AR-/-小鼠波幅明顯高于野生型小鼠，說(shuō)明ONC模型可靠； 在第二部分實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（假手術(shù)組）相比，ONC后第3d、7d、14d，AR+/+-Thy1-YFP小鼠和AR-/--Thy1-YFP小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，AR-/--Thy1-YFP小鼠存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯多于AR+/+-Thy1-YFP小鼠；ONC后第7天野生型小鼠夾傷區(qū)域及遠(yuǎn)側(cè)端沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的再生神經(jīng)纖維，AR敲除小鼠ONC區(qū)域及遠(yuǎn)側(cè)端則發(fā)現(xiàn)較多的綠色熒光標(biāo)記纖維，提示有明顯的神經(jīng)纖維再生。為了探討AR對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，AR敲除小鼠ONC后第7天Iba-1染色后可見(jiàn)活化的巨噬細(xì)胞；ONC后0d、3d、5d、7d、14d，Western blot法檢測(cè)iNOS（M1標(biāo)志性分子）和Arg1（M2標(biāo)志性分子）顯示：在各時(shí)間點(diǎn)Arg1/iNOS的比值A(chǔ)R敲除小鼠明顯大于野生型小鼠。 以上實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：野生型小鼠ONC后AR表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，提示AR參與了損傷過(guò)程。ONC后，AR敲除小鼠F-VEP P1峰時(shí)值明顯短于野生型小鼠，而波幅明顯高于野生型小鼠，說(shuō)明其視神經(jīng)髓鞘功能優(yōu)于野生型小鼠，提示AR基因敲除可促進(jìn)小鼠ONC后視神經(jīng)的傳導(dǎo)功能；同時(shí)，ONC后，AR敲除小鼠存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及視神經(jīng)纖維的長(zhǎng)度都明顯多于野生型小鼠，提示AR基因敲除不僅可以促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活還可促進(jìn)視神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。ONC后，各時(shí)間點(diǎn)在Arg1/iNOS的比值上AR敲除小鼠明顯大于野生型小鼠，提示AR可能通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)視神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：醛糖還原酶 視神經(jīng)夾傷 視神經(jīng) M2型巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R774.6
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-24
• 1. 視神經(jīng)損傷后的病理變化15-18
• 2. 小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)視神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)18
• 3. 視神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)和軸突再生18-20
• 4. AR基因的作用及在眼科方面的研究20-24
• 實(shí)驗(yàn)一 建立視神經(jīng)夾傷模型并觀察 AR 在 ONC 后視神經(jīng)上的表達(dá)變化24-35
• 引言24-25
• 1 材料25-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑25
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 1.4 實(shí)驗(yàn)抗體26
• 2 方法26-30
• 2.1 小鼠 ONC 模型制備26
• 2.2 western blot 實(shí)驗(yàn)26-28
• 2.3 QPCR 實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.4 小鼠閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（F-VEP）檢測(cè)29-30
• 2.5 SPSS16.0 處理分析數(shù)據(jù)30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 3.1 ONC 后情況30
• 3.2 AR 蛋白表達(dá)變化30-31
• 3.3 AR 基因 QPCR 結(jié)果31-32
• 3.4 視覺(jué)電生理 F-VEP32-33
• 4 討論33-35
• 實(shí)驗(yàn)二 AR 敲除促進(jìn)視神經(jīng)再生及可能機(jī)制35-44
• 引言35-36
• 1 材料36-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36
• 1.2 主要試劑36
• 1.3 主要儀器36
• 1.4 實(shí)驗(yàn)抗體36-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 2.1 小鼠 ONC 模型（同實(shí)驗(yàn)一）37
• 2.2 小鼠視神經(jīng)灌注、取材（組織準(zhǔn)備）37
• 2.3 獲取 AR-/-YFP 小鼠37-38
• 2.4 CTB 追蹤再生神經(jīng)纖維38
• 2.5 免疫熒光組織化學(xué)染色38-39
• 2.6 western Blot(同實(shí)驗(yàn)一)39
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（同實(shí)驗(yàn)一）39
• 3 結(jié)果39-42
• 3.1 AR 基因敲除后對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活的影響39-40
• 3.2 AR 基因敲除對(duì) ONC 后視神經(jīng)纖維再生的影響40-41
• 3.3 AR 基因敲除對(duì) ONC 后巨噬細(xì)胞極化的影響41-42
• 4 討論42-44
• 小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-53
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果53-54
• 致謝54

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳軍;王愛(ài)桃;閔U

本文編號(hào)：259191