【摘要】：下咽鱗狀細胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)在頭頸部惡性腫瘤相對較為少見,但近年來發(fā)病率呈較快上升趨勢,其總的發(fā)病率約占頭頸部腫瘤的5%左右[1]。下咽癌早期的臨床表現(xiàn)主要是咽部異物堵塞感、吞咽哽噎感,隨著腫瘤瘤體的增大,尤其當表面發(fā)生潰瘍及糜爛時,可引起吞咽不適伴有局部疼痛、同側耳部可能出現(xiàn)反射性耳痛及痰中帶血絲等不適,常伴有進行性的吞咽困難,當腫瘤累及喉腔時可出現(xiàn)聲音嘶啞、發(fā)聲及呼吸費力等癥狀。下咽癌最常見的發(fā)病部位位于梨狀窩區(qū)(70%～80%),其次為下咽后壁區(qū)(5%～22%),環(huán)后區(qū)最為少見[2]。因下咽癌中95%以上為鱗狀細胞癌,且大多數(shù)分化程度較差,易粘膜下浸潤擴散,是頭頸部惡性程度最高的腫瘤之一,且患者早期臨床癥狀不明顯,因此,在耳鼻喉頭頸外科就診時多數(shù)患者已是晚期(III期和IV期),腫瘤病變已擴散至舌根、喉腔和頸段食管等部位,而且常常伴有多處頸部淋巴結的轉移,往往導致預后不良[3]。目前,HSCC治療的目標是盡可能的根除腫瘤,減少手術的并發(fā)癥,延長患者的生命,提高患者的生存質量。隨著頭頸部腫瘤診段及治療技術水平的不斷提高,諸如放療、化療、手術或三種方法相結合的綜合治療等多種方案被應用于HSCC的臨床治療中[4,5,6]。其中,手術加放化療的綜合治療方案是目前的主要治療手段。雖然放化療及手術技術等治療手段都有了較大的發(fā)展,HSCC患者生存率較前有所改善,但由于HSCC患者就診時多處于疾病較為晚期的階段,且由于HSCC惡性程度較高,解剖位置深在,易于局部擴散和遠處轉移等特點,HSCC復發(fā)率仍較高,有研究[7]表明臨床III期和IV期的HSCC患者5年生存率僅為25%-40%。因此,更加深入地研究HSCC的生物學特性,據(jù)此尋找腫瘤特異性的標志物,不斷探求HSCC的早期診斷方法及更加高效的綜合治療方案成為目前頭頸腫瘤外科亟待研究和解決的課題。ETS家族是目前所知最大的信號依賴的轉錄因子家族之一,目前所知,該家族共包含30多個成員,其通過調節(jié)細胞的增殖與分化、調節(jié)細胞凋亡[8,9,10]及上皮-間充質之間的相互作用,參與眾多的生理和病理過程[11,12]。內皮細胞的增殖[13,14]、遷移、管腔形態(tài)的分化[15,16],將會導致腫瘤血管的生成[17,18]。近期的研究發(fā)現(xiàn),ETS的家族成員ETS-1可參與腫瘤血管的生成,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的過程中發(fā)揮了極為重要的作用[19,20]。ETS轉錄因子家族由原癌基因v-ETS編碼,迄今為止已經發(fā)現(xiàn)了 30多個家族成員,包括:ETS-1、ETS-2、GABP α(GA-binding protein alpha)、Spi-1(salmonella pathogenicity island 1)等[21,22]。ETS2 為 E26 轉錄因子 2(E26 oncogene homolog 2),是眾多的ETS轉錄因子家族成員之一,是細胞信號傳導通路的效應產物,其可以調控眾多的下游靶基因,通過調控各種信號通路或者調節(jié)各效應蛋白之間的相互作用,從而調節(jié)效應細胞的增殖、分化、凋亡以及血管的生成等[23,24]。ETS2在很多的組織和細胞中都有表達,研究發(fā)現(xiàn),在不同的組織中ETS2的表達的量以及其功能也存在較大的差異,很多腫瘤中如肝癌[25]小細胞肺癌[26]、食管癌[27,28]、結腸癌[29,30]、乳腺癌[31,32]以及惡性血液腫瘤[33,34]等均可以發(fā)現(xiàn)ETS2基因的表達異常,推測ETS2的異常表達或易位會形成融合蛋白,可能與腫瘤的發(fā)生及進展關系密切,轉錄因子ETS2有可能成為腫瘤的潛在診斷的標志物,也有可能成為一個新的治療靶點。因此,我們設計實驗研究轉錄因子ETS2在HSCC的表達及發(fā)生發(fā)展中的作用機制,能夠為HSCC的發(fā)生機制及生物治療提供理論基礎和實踐指導,具有較大的理論及臨床指導意義。目前尚未發(fā)現(xiàn)關于ETS2在HSCC組織及細胞中的表達及相關機制的研究報道。在本項課題研究中,我們分別從mRNA及蛋白水平檢測了 ETS2在HSCC腫瘤組織和癌旁粘膜組織中的表達情況,并對患者進行定期規(guī)范的術后隨訪,詳細記錄相關的數(shù)據(jù)并分析探討ETS2的表達與下咽鱗狀細胞癌患者的年齡、性別、發(fā)病部位,腫瘤分級,頸部淋巴結轉移情況,組織病理學分級,臨床分期和預后之間的關系。利用小干擾RNA技術在人HSCC FaDu細胞系中敲掉ETS2,設計多項實驗檢測ETS2的低表達對人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉移的影響,并探討其可能的機制。第一部分ETS2在下咽鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義研究目的:研究ETS2在下咽鱗狀細胞癌中的表達,并對ETS2的表達與患者臨床病理特征以及預后之間的關系進行分析。實驗方法:1.所有的組織學標本均來自山東大學齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院的患者,收集下咽鱗狀細胞癌手術患者術后的腫瘤組織標本和距離腫塊2cm以上的形態(tài)學正常的黏膜組織樣本,并詳細記錄患者的臨床病歷資料。2.應用免疫組化染色的方法檢測ETS2在癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標本中的表達。3.腫瘤組織和非腫瘤粘膜組織中的總RNA使用Trizol法來提取,利用Real-time PCR方法比較癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標本中ETS2在mRNA水平上的表達差異。4.從組織標本中提取總蛋白,應用蛋白質免疫印跡(Western Blot)的方法檢測并比較癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標本中ETS2在蛋白水平上的表達差異。5.ETS2在HSCC癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織樣本中免疫組織化學染色陽性率的比較使用Pearson卡方檢驗分析;ETS2在癌組織及癌旁非腫瘤黏膜組織中mRNA的表達情況、蛋白質印跡分析蛋白定量結果的比較應用Wilcoxon秩和檢驗分析。ETS2相對表達量用平均值±標準差來表示,ETS2的表達與HSCC臨床病理特征之間關系的分析采用卡方檢驗。應用Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線,差異分析應用log-rank檢驗。采用單因素的Cox回歸分析ETS2的陽性表達及臨床分期等因素對患者預后的影響,使用多因素Cox回歸分析影響HSCC患者預后的獨立危險因素。所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,所有統(tǒng)計學分析均為雙側,當p0.05時被認為具有統(tǒng)計學意義。實驗結果:1.共計58例下咽鱗狀細胞癌手術患者入選此次研究,共收集到腫瘤標本58例,收集到癌旁非腫瘤的正常黏膜組織52例,其中梨狀窩癌44例,環(huán)狀軟骨后區(qū)及下咽后壁區(qū)癌共計14例。T3和T4期患者共40例,占比69%,伴有淋巴結轉移的患者有45例,占總患者數(shù)的77.6%,病理檢查結果為高分化鱗癌16例,占27.6%,中等分化與低分化病例共42例,占72.4%,III-IV期的患者共有43例接近所選病例的3/4(74.1%)。所有入選的患者術后均經病理證實為鱗狀細胞癌,所有患者標本的切緣均為陰性。2.免疫組化檢查結果顯示:ETS2在細胞核和細胞質中呈陽性表達,但主要表達在細胞核上,ETS2在81.0%(47/58)的癌組織中呈現(xiàn)陽性表達,在23.1%(12/52)的癌旁正常粘膜組織中表達陽性(p0,001),統(tǒng)計結果表明:ETS2在下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織中的表達明顯高于癌旁正常黏膜組織。3.Real-time PCR檢查結果顯示ETS2 mRNA在下咽癌腫瘤組織中的相對表達量(2.497 ± 0.163)較癌旁非腫瘤黏膜組織中(1.095 ± 0.058)明顯增高,統(tǒng)計學分析表明,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001)。4.Western Blot結果顯示:ETS2在下咽癌腫瘤組織中的相對的蛋白表達量為0.674±0.026,較癌旁非腫瘤的黏膜組織中相對的蛋白表達量(0.211 ±0.035)顯著升高,經過統(tǒng)計分析,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。5.ETS2的陽性表達與原發(fā)腫瘤分級(p0.001),同時與腫瘤的臨床TNM分期(p0.001)和組織病理學分級(p0.001)以及頸部的區(qū)域淋巴結轉移(p=0.005)有關,此外,ETS2的表達與患者腫瘤的原發(fā)部位、年齡和性別是不相關的。6.在所有納入研究的患者之中,ETS2陽性表達的總體生存率顯著低于ETS2陰性表達的患者(p0.01),單因素的Cox回歸分析,分析結果顯示:原發(fā)腫瘤的大小及分級(p=0.0043),區(qū)域性的淋巴結轉移情況(p=0.0012),腫瘤的臨床TNM分期(p=0.0008),腫瘤標本的ETS2的陽性表達(p0.001)均和患者的預后相關,多因素Cox比例風險回歸分析中,腫瘤標本的ETS2的陽性表達是影響患者預后的獨立的危險因素(p=0.003,HR 6.343,95%CI 2.211-15.786)。實驗結論:ETS2在下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織中的表達顯著增加,這種ETS2異常的表達與HSCC原發(fā)腫瘤的分級、區(qū)域性的淋巴結轉移情況、組織病理學分級和腫瘤的臨床TNM分期有關。ETS2的陽性表達與患者預后不良相關,此外,腫瘤標本的ETS2的陽性表達是影響患者預后的獨立的危險因素,這些實驗結果提示ETS2基因有可能成為治療HSCC的新的靶向分子。第二部分基因敲除ETS2對下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系的細胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉移的影響及機制研究。研究目的:將ETS2-siRNA轉染至人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系中,從而研究基因敲除ETS2對細胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉移的影響及機制。實驗方法:1.培養(yǎng)下咽癌細胞株FaDu細胞系,設計合成3組siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并設置 了陰性對照組 NC siRNA,采用的是 Lipofectamin 2000脂質體法進行轉染。實驗分三種濃度進行,分別為25nM,50nM,100nM依次進行,轉染成功后,應用Real-time PCR及Western blot實驗的方法檢測siRNA的轉染效率,從而篩選最適合的siRNA進行下一步實驗。2.實驗分為Control組、NC組、siRNA-ETS2組三組,應用CCK8和Brdu法,檢測各組細胞的增殖情況,研究敲出ETS2后對HSCC FaDu細胞系細胞增殖的影響。3.應用流式細胞儀檢測敲出ETS2后對HSCC FaDu細胞系細胞周期的影響。4.應用流式細胞儀和Hoechst染色檢測三組細胞細胞凋亡的情況,研究敲除ETS2后對HSCC FaDu細胞系細胞凋亡的影響。5.應用Western Blot技術檢測凋亡相關蛋白Bc12及Caspase3的表達情況,探討敲出ETS2基因后對HSCC FaDu細胞系細胞凋亡的影響機制。6.應用Transwell侵襲實驗及細胞劃痕檢測三組細胞的遷移侵襲能力,研究敲除ETS2基因后,FaDu細胞轉移侵襲能力的變化。7.使用Western Blot技術的檢測細胞中上皮標志物:E-cadherin,ZQ-1和間質標志物:Vimentin,α-SMA的表達,從而檢測ETS2基因對FaDu細胞系上皮細胞-間充質轉化(EMT)的影響。8.使用Western Blot技術檢測MAPK信號通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-JNK相關蛋白的表達情況,探索ETS2對癌細胞MAPK信號通路的影響及影響細胞凋亡及遷移轉移的途徑。9.使用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,每個實驗至少獨立重復了 3次,所有的實驗數(shù)據(jù)均按照平均值±標準差來表示,不同組別之間的差異用t檢驗或單因素方差分析來進行評估,所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)及分析均是P0.05時,被認為具有統(tǒng)計學意義。實驗結果:1.成功設計并合成了 3 組 siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并設置了陰性對照組NC siRNA,為了找尋最佳的實驗濃度提高轉染的效率,實驗分三種濃度進行,分別為25nM,50nM,10OnM依次進行,采用Lipofectamin2000脂質體法進行轉染,應用Real-time PCR的方法檢測siRNA的轉染效率,實驗表明:最佳的轉染濃度在1OOnM,在10OnM時NC-siRNA組、siRNA-1組,siRNA-2組,siRNA-3 組中 ETS2 的相對表達量分別為 1.000±0.046、0.561 ±0.034、0.334±0.023和0.156±0.016各組之間的差異具統(tǒng)計學意義(p0.001),其中,siRNA-3瞬時轉染效率可達80%左右。Western blot實驗結果顯示:經過siRNA-3轉染下咽癌FaDu細胞系后,細胞的ETS2蛋白表達受到明顯的抑制,ETS2蛋白在Control組、NC組、siRNA3轉染組的相對表達量為1.012±0.031、0.992±0.022和0.213±0.015,差別具有統(tǒng)計學意義(p0.001)。2.應用Brdu染色檢測各組細胞增殖情況,結果顯示:相較對照組而言,siRNA-ETS2組染色細胞數(shù)量明顯減少,表明細胞的增殖活性受到明顯的抑制;應用CCK8法檢測各組細胞增殖情況,結果顯示:分別與Control組和NC組相比較,敲除ETS2后在12h內FaDu細胞增殖未見明顯差異,但在48h和72h后,FaDu細胞增殖受到明顯的抑制(p0.05)。實驗表明:通過ETS2-siRNA轉染FaDu細胞系造成ETS2的低表達,對FaDu細胞增殖活性產生了明顯的抑制。3.應用流式細胞儀檢測ETS2對FaDu細胞周期的影響,結果顯示:Control組、NC組和siRNA-ETS2組細胞周期位于G0/G1期的比例依次為59.4%、57.2%、69。3%,細胞周期位于S期的比例依次為31.4%、33.4%、21%,細胞周期位于G2/M期的比例依次為9.2%、9.4%、9.7%,由此可見,行ETS2基因敲出的實驗組siRNA-ETS2組相對于對照組,能夠顯著的誘導FaDu細胞聚集于G0/G1期,從而減少了 S期的細胞比率(p＜0.01)。4.使用Hoechst檢測三組細胞凋亡,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞核呈藍色團塊狀,凋亡發(fā)生后,可以發(fā)現(xiàn)藍色團塊及細胞核的碎裂,染色質因皺縮而發(fā)生的高亮。采用流式細胞儀檢測了三組細胞凋亡率分別為:4.65%±0.53%、4.52%±0.48%和29.12%± 1.02%,siRNA-ETS2組細胞的凋亡率較對照組明顯升高(p0.01)。5.應用Western Blot技術檢測凋亡相關蛋白Bc12/Caspase3的表達情況,結果顯示:Control組,NC組和siRNA-ETS2組的Caspase3的相對表達量分別為1.012±0.033,1.098±0.064 和 2.859±0.102,三者相比,siRNA-ETS2 組的 Caspase3的相對表達量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(p0.001);Control組,NC組和 siRNA-ETS2 組的 Bc12 的相對表達量為 1.119±0.029,1.090±0.018 和 0.549±0.013,三者相比,siRNA-ETS2組的Bc12的相對表達量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。6.應用Transwell侵襲實驗檢測敲除ETS2基因后,FaDu細胞轉移侵襲能力的變化,鏡下觀察transwell下室中細胞遷移及侵襲情況并計數(shù),統(tǒng)計學分析表明:與Control組、NC組相比較,siRNA-ETS2組細胞的侵襲及遷移數(shù)量明顯減少(p0.01);細胞劃痕實驗顯示:被敲掉ETS2基因后的FaDu細胞48h后的細胞遷移距離小于Control組和NC組,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01),實驗表明:當FaDu細胞被敲掉ETS2基因后,顯著減弱了細胞的侵襲和轉移能力。7.使用Western Blot技術的檢測細胞中上皮標志物,結果表明:Control組,NC組和siRNA-ETS2組的上皮標志物E-cadherin的相對表達量分別為1.097±0.043,0.986 ±0.023和3.879±0.124,三組的上皮標志物ZQ-1的相對表達量分別為 1.055±0.075,0.093±0.056 和 4.198±0.176,siRNA-ETS2 組和對照組相比,E-cadherin和ZQ-1的相對表達量明顯上調,差異有顯著統(tǒng)計學意義(p0.001)。三組之間的間質標志物Vimentin的相對表達量為1.118±0.033,1.123±0.081和0.335±0.022,α-SMA 的相對表達量為 1.012±0.021,1.114±0.062 和 0.298士0.014,siRNA-ETS2組和對照組相比,其Vimentin及α-SMA的表達明顯下調,其差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。分析表明:抑制了 ETS2的表達后,腫瘤細胞通過增加E-cadherin,ZQ-1的表達和減少Vimentin和α-SMA的表達從而抑制了細胞間充質轉化的進程。8.使用Western Blot技術檢測MAPK信號通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-ERK相關蛋白的表達情況,結果表明:當TGF-β誘導的細胞激活后,細胞中p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白的相對表達量較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01),但TGF-β +siRNA組的p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白和TGF-β組,TGF-β+NC組相比較而言,其升高程度受限,差異明顯(p0.01),研究證實:ETS2被敲除后,會導致MAPK/p38/ERK/JNK的信號通路受到抑制,表明在TGF-β誘導的腫瘤的上皮細胞-間充質轉化(EMT)過程中,ETS2通過MAPK信號通路發(fā)揮了重要作用。實驗結論:通過ETS2-siRNA轉染人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系從而敲除ETS2后,與對照組相比可誘導FaDu細胞聚集于G0/G1期,顯著抑制細胞的增殖,并促進了 FaDu細胞的凋亡;通過抑制了 MAPK/p38/ERK/JNK的信號通路,抑制了細胞間充質轉化的進程,從而減弱了細胞的侵襲和轉移能力。
【圖文】：

圖１：邋ＥＴＳ２免疫組化染色圖片逡逑Ａ：邋ＥＴＳ２在癌旁正常黏膜組織中的陰性表達（２００Ｘ）逡逑Ｂ：邋ＥＴＳ２在腫瘤組織中的陽性表達（２００Ｘ）逡逑Ｃ：邋ＥＴＳ２在癌旁正常黏膜組織中的陰性表達（４００Ｘ）逡逑Ｄ：邋ＥＴＳ２在腫瘤組織中的高表達（４００Ｘ）逡逑

圖２．邋ＥＴＳ２在腫瘤組織和癌旁正常粘膜組織中的表達。逡逑Ａ：邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測ＥＴＳ２在ｍＲＮＡ水平的表達，與對照組相比，ＥＴＳ２邋ｍＲＮＡ逡逑水平在腫瘤組織樣本中表達顯著增高（Ｐ＜0．邋00１）；逡逑Ｂ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測ＥＴＳ２在蛋白水平的表達，與對照組相比，ＥＴＳ２蛋白逡逑水平在腫瘤組織中的表達明顯增高（Ｐ＜0．邋00１）；逡逑Ｃ；邋ＥＴＳ２在蛋白水平的表達情況。逡逑５７逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 吳豪陽;王樹斌;曹選平;;轉錄調節(jié)因子Ets-1在口腔鱗癌中的表達及其意義[J];醫(yī)藥論壇雜志;2009年04期

2 ;Overexpression of ETS2 in human esophageal squamous cell carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2003年02期

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本文編號：2591454