【摘要】：下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)在頭頸部惡性腫瘤相對(duì)較為少見(jiàn),但近年來(lái)發(fā)病率呈較快上升趨勢(shì),其總的發(fā)病率約占頭頸部腫瘤的5%左右[1]。下咽癌早期的臨床表現(xiàn)主要是咽部異物堵塞感、吞咽哽噎感,隨著腫瘤瘤體的增大,尤其當(dāng)表面發(fā)生潰瘍及糜爛時(shí),可引起吞咽不適伴有局部疼痛、同側(cè)耳部可能出現(xiàn)反射性耳痛及痰中帶血絲等不適,常伴有進(jìn)行性的吞咽困難,當(dāng)腫瘤累及喉腔時(shí)可出現(xiàn)聲音嘶啞、發(fā)聲及呼吸費(fèi)力等癥狀。下咽癌最常見(jiàn)的發(fā)病部位位于梨狀窩區(qū)(70%～80%),其次為下咽后壁區(qū)(5%～22%),環(huán)后區(qū)最為少見(jiàn)[2]。因下咽癌中95%以上為鱗狀細(xì)胞癌,且大多數(shù)分化程度較差,易粘膜下浸潤(rùn)擴(kuò)散,是頭頸部惡性程度最高的腫瘤之一,且患者早期臨床癥狀不明顯,因此,在耳鼻喉頭頸外科就診時(shí)多數(shù)患者已是晚期(III期和IV期),腫瘤病變已擴(kuò)散至舌根、喉腔和頸段食管等部位,而且常常伴有多處頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,往往導(dǎo)致預(yù)后不良[3]。目前,HSCC治療的目標(biāo)是盡可能的根除腫瘤,減少手術(shù)的并發(fā)癥,延長(zhǎng)患者的生命,提高患者的生存質(zhì)量。隨著頭頸部腫瘤診段及治療技術(shù)水平的不斷提高,諸如放療、化療、手術(shù)或三種方法相結(jié)合的綜合治療等多種方案被應(yīng)用于HSCC的臨床治療中[4,5,6]。其中,手術(shù)加放化療的綜合治療方案是目前的主要治療手段。雖然放化療及手術(shù)技術(shù)等治療手段都有了較大的發(fā)展,HSCC患者生存率較前有所改善,但由于HSCC患者就診時(shí)多處于疾病較為晚期的階段,且由于HSCC惡性程度較高,解剖位置深在,易于局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),HSCC復(fù)發(fā)率仍較高,有研究[7]表明臨床III期和IV期的HSCC患者5年生存率僅為25%-40%。因此,更加深入地研究HSCC的生物學(xué)特性,據(jù)此尋找腫瘤特異性的標(biāo)志物,不斷探求HSCC的早期診斷方法及更加高效的綜合治療方案成為目前頭頸腫瘤外科亟待研究和解決的課題。ETS家族是目前所知最大的信號(hào)依賴的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,目前所知,該家族共包含30多個(gè)成員,其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[8,9,10]及上皮-間充質(zhì)之間的相互作用,參與眾多的生理和病理過(guò)程[11,12]。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[13,14]、遷移、管腔形態(tài)的分化[15,16],將會(huì)導(dǎo)致腫瘤血管的生成[17,18]。近期的研究發(fā)現(xiàn),ETS的家族成員ETS-1可參與腫瘤血管的生成,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了極為重要的作用[19,20]。ETS轉(zhuǎn)錄因子家族由原癌基因v-ETS編碼,迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 30多個(gè)家族成員,包括:ETS-1、ETS-2、GABP α(GA-binding protein alpha)、Spi-1(salmonella pathogenicity island 1)等[21,22]。ETS2 為 E26 轉(zhuǎn)錄因子 2(E26 oncogene homolog 2),是眾多的ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的效應(yīng)產(chǎn)物,其可以調(diào)控眾多的下游靶基因,通過(guò)調(diào)控各種信號(hào)通路或者調(diào)節(jié)各效應(yīng)蛋白之間的相互作用,從而調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及血管的生成等[23,24]。ETS2在很多的組織和細(xì)胞中都有表達(dá),研究發(fā)現(xiàn),在不同的組織中ETS2的表達(dá)的量以及其功能也存在較大的差異,很多腫瘤中如肝癌[25]小細(xì)胞肺癌[26]、食管癌[27,28]、結(jié)腸癌[29,30]、乳腺癌[31,32]以及惡性血液腫瘤[33,34]等均可以發(fā)現(xiàn)ETS2基因的表達(dá)異常,推測(cè)ETS2的異常表達(dá)或易位會(huì)形成融合蛋白,可能與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切,轉(zhuǎn)錄因子ETS2有可能成為腫瘤的潛在診斷的標(biāo)志物,也有可能成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)錄因子ETS2在HSCC的表達(dá)及發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,能夠?yàn)镠SCC的發(fā)生機(jī)制及生物治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo),具有較大的理論及臨床指導(dǎo)意義。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于ETS2在HSCC組織及細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道。在本項(xiàng)課題研究中,我們分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)了 ETS2在HSCC腫瘤組織和癌旁粘膜組織中的表達(dá)情況,并對(duì)患者進(jìn)行定期規(guī)范的術(shù)后隨訪,詳細(xì)記錄相關(guān)的數(shù)據(jù)并分析探討ETS2的表達(dá)與下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的年齡、性別、發(fā)病部位,腫瘤分級(jí),頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,組織病理學(xué)分級(jí),臨床分期和預(yù)后之間的關(guān)系。利用小干擾RNA技術(shù)在人HSCC FaDu細(xì)胞系中敲掉ETS2,設(shè)計(jì)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ETS2的低表達(dá)對(duì)人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的影響,并探討其可能的機(jī)制。第一部分ETS2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義研究目的:研究ETS2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá),并對(duì)ETS2的表達(dá)與患者臨床病理特征以及預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)方法:1.所有的組織學(xué)標(biāo)本均來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院的患者,收集下咽鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)患者術(shù)后的腫瘤組織標(biāo)本和距離腫塊2cm以上的形態(tài)學(xué)正常的黏膜組織樣本,并詳細(xì)記錄患者的臨床病歷資料。2.應(yīng)用免疫組化染色的方法檢測(cè)ETS2在癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標(biāo)本中的表達(dá)。3.腫瘤組織和非腫瘤粘膜組織中的總RNA使用Trizol法來(lái)提取,利用Real-time PCR方法比較癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標(biāo)本中ETS2在mRNA水平上的表達(dá)差異。4.從組織標(biāo)本中提取總蛋白,應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)的方法檢測(cè)并比較癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織標(biāo)本中ETS2在蛋白水平上的表達(dá)差異。5.ETS2在HSCC癌組織及癌旁非腫瘤的黏膜組織樣本中免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性率的比較使用Pearson卡方檢驗(yàn)分析;ETS2在癌組織及癌旁非腫瘤黏膜組織中mRNA的表達(dá)情況、蛋白質(zhì)印跡分析蛋白定量結(jié)果的比較應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析。ETS2相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,ETS2的表達(dá)與HSCC臨床病理特征之間關(guān)系的分析采用卡方檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線,差異分析應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)。采用單因素的Cox回歸分析ETS2的陽(yáng)性表達(dá)及臨床分期等因素對(duì)患者預(yù)后的影響,使用多因素Cox回歸分析影響HSCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè),當(dāng)p0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.共計(jì)58例下咽鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)患者入選此次研究,共收集到腫瘤標(biāo)本58例,收集到癌旁非腫瘤的正常黏膜組織52例,其中梨狀窩癌44例,環(huán)狀軟骨后區(qū)及下咽后壁區(qū)癌共計(jì)14例。T3和T4期患者共40例,占比69%,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有45例,占總患者數(shù)的77.6%,病理檢查結(jié)果為高分化鱗癌16例,占27.6%,中等分化與低分化病例共42例,占72.4%,III-IV期的患者共有43例接近所選病例的3/4(74.1%)。所有入選的患者術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌,所有患者標(biāo)本的切緣均為陰性。2.免疫組化檢查結(jié)果顯示:ETS2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá),但主要表達(dá)在細(xì)胞核上,ETS2在81.0%(47/58)的癌組織中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá),在23.1%(12/52)的癌旁正常粘膜組織中表達(dá)陽(yáng)性(p0,001),統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:ETS2在下咽鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜組織。3.Real-time PCR檢查結(jié)果顯示ETS2 mRNA在下咽癌腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量(2.497 ± 0.163)較癌旁非腫瘤黏膜組織中(1.095 ± 0.058)明顯增高,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。4.Western Blot結(jié)果顯示:ETS2在下咽癌腫瘤組織中的相對(duì)的蛋白表達(dá)量為0.674±0.026,較癌旁非腫瘤的黏膜組織中相對(duì)的蛋白表達(dá)量(0.211 ±0.035)顯著升高,經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。5.ETS2的陽(yáng)性表達(dá)與原發(fā)腫瘤分級(jí)(p0.001),同時(shí)與腫瘤的臨床TNM分期(p0.001)和組織病理學(xué)分級(jí)(p0.001)以及頸部的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.005)有關(guān),此外,ETS2的表達(dá)與患者腫瘤的原發(fā)部位、年齡和性別是不相關(guān)的。6.在所有納入研究的患者之中,ETS2陽(yáng)性表達(dá)的總體生存率顯著低于ETS2陰性表達(dá)的患者(p0.01),單因素的Cox回歸分析,分析結(jié)果顯示:原發(fā)腫瘤的大小及分級(jí)(p=0.0043),區(qū)域性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(p=0.0012),腫瘤的臨床TNM分期(p=0.0008),腫瘤標(biāo)本的ETS2的陽(yáng)性表達(dá)(p0.001)均和患者的預(yù)后相關(guān),多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析中,腫瘤標(biāo)本的ETS2的陽(yáng)性表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素(p=0.003,HR 6.343,95%CI 2.211-15.786)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:ETS2在下咽鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中的表達(dá)顯著增加,這種ETS2異常的表達(dá)與HSCC原發(fā)腫瘤的分級(jí)、區(qū)域性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織病理學(xué)分級(jí)和腫瘤的臨床TNM分期有關(guān)。ETS2的陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān),此外,腫瘤標(biāo)本的ETS2的陽(yáng)性表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ETS2基因有可能成為治療HSCC的新的靶向分子。第二部分基因敲除ETS2對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系的細(xì)胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究。研究目的:將ETS2-siRNA轉(zhuǎn)染至人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系中,從而研究基因敲除ETS2對(duì)細(xì)胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.培養(yǎng)下咽癌細(xì)胞株FaDu細(xì)胞系,設(shè)計(jì)合成3組siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并設(shè)置 了陰性對(duì)照組 NC siRNA,采用的是 Lipofectamin 2000脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分三種濃度進(jìn)行,分別為25nM,50nM,100nM依次進(jìn)行,轉(zhuǎn)染成功后,應(yīng)用Real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率,從而篩選最適合的siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)分為Control組、NC組、siRNA-ETS2組三組,應(yīng)用CCK8和Brdu法,檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況,研究敲出ETS2后對(duì)HSCC FaDu細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響。3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲出ETS2后對(duì)HSCC FaDu細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響。4.應(yīng)用流式細(xì)胞儀和Hoechst染色檢測(cè)三組細(xì)胞細(xì)胞凋亡的情況,研究敲除ETS2后對(duì)HSCC FaDu細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響。5.應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bc12及Caspase3的表達(dá)情況,探討敲出ETS2基因后對(duì)HSCC FaDu細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。6.應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕檢測(cè)三組細(xì)胞的遷移侵襲能力,研究敲除ETS2基因后,FaDu細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的變化。7.使用Western Blot技術(shù)的檢測(cè)細(xì)胞中上皮標(biāo)志物:E-cadherin,ZQ-1和間質(zhì)標(biāo)志物:Vimentin,α-SMA的表達(dá),從而檢測(cè)ETS2基因?qū)aDu細(xì)胞系上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。8.使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)MAPK信號(hào)通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-JNK相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,探索ETS2對(duì)癌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響及影響細(xì)胞凋亡及遷移轉(zhuǎn)移的途徑。9.使用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)了 3次,所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,不同組別之間的差異用t檢驗(yàn)或單因素方差分析來(lái)進(jìn)行評(píng)估,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)及分析均是P0.05時(shí),被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.成功設(shè)計(jì)并合成了 3 組 siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并設(shè)置了陰性對(duì)照組NC siRNA,為了找尋最佳的實(shí)驗(yàn)濃度提高轉(zhuǎn)染的效率,實(shí)驗(yàn)分三種濃度進(jìn)行,分別為25nM,50nM,10OnM依次進(jìn)行,采用Lipofectamin2000脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,應(yīng)用Real-time PCR的方法檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率,實(shí)驗(yàn)表明:最佳的轉(zhuǎn)染濃度在1OOnM,在10OnM時(shí)NC-siRNA組、siRNA-1組,siRNA-2組,siRNA-3 組中 ETS2 的相對(duì)表達(dá)量分別為 1.000±0.046、0.561 ±0.034、0.334±0.023和0.156±0.016各組之間的差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),其中,siRNA-3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%左右。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)siRNA-3轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞系后,細(xì)胞的ETS2蛋白表達(dá)受到明顯的抑制,ETS2蛋白在Control組、NC組、siRNA3轉(zhuǎn)染組的相對(duì)表達(dá)量為1.012±0.031、0.992±0.022和0.213±0.015,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。2.應(yīng)用Brdu染色檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,結(jié)果顯示:相較對(duì)照組而言,siRNA-ETS2組染色細(xì)胞數(shù)量明顯減少,表明細(xì)胞的增殖活性受到明顯的抑制;應(yīng)用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,結(jié)果顯示:分別與Control組和NC組相比較,敲除ETS2后在12h內(nèi)FaDu細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯差異,但在48h和72h后,FaDu細(xì)胞增殖受到明顯的抑制(p0.05)。實(shí)驗(yàn)表明:通過(guò)ETS2-siRNA轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞系造成ETS2的低表達(dá),對(duì)FaDu細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生了明顯的抑制。3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ETS2對(duì)FaDu細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示:Control組、NC組和siRNA-ETS2組細(xì)胞周期位于G0/G1期的比例依次為59.4%、57.2%、69。3%,細(xì)胞周期位于S期的比例依次為31.4%、33.4%、21%,細(xì)胞周期位于G2/M期的比例依次為9.2%、9.4%、9.7%,由此可見(jiàn),行ETS2基因敲出的實(shí)驗(yàn)組siRNA-ETS2組相對(duì)于對(duì)照組,能夠顯著的誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞聚集于G0/G1期,從而減少了 S期的細(xì)胞比率(p＜0.01)。4.使用Hoechst檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色團(tuán)塊狀,凋亡發(fā)生后,可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)色團(tuán)塊及細(xì)胞核的碎裂,染色質(zhì)因皺縮而發(fā)生的高亮。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了三組細(xì)胞凋亡率分別為:4.65%±0.53%、4.52%±0.48%和29.12%± 1.02%,siRNA-ETS2組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組明顯升高(p0.01)。5.應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bc12/Caspase3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:Control組,NC組和siRNA-ETS2組的Caspase3的相對(duì)表達(dá)量分別為1.012±0.033,1.098±0.064 和 2.859±0.102,三者相比,siRNA-ETS2 組的 Caspase3的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);Control組,NC組和 siRNA-ETS2 組的 Bc12 的相對(duì)表達(dá)量為 1.119±0.029,1.090±0.018 和 0.549±0.013,三者相比,siRNA-ETS2組的Bc12的相對(duì)表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。6.應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除ETS2基因后,FaDu細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的變化,鏡下觀察transwell下室中細(xì)胞遷移及侵襲情況并計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明:與Control組、NC組相比較,siRNA-ETS2組細(xì)胞的侵襲及遷移數(shù)量明顯減少(p0.01);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:被敲掉ETS2基因后的FaDu細(xì)胞48h后的細(xì)胞遷移距離小于Control組和NC組,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)FaDu細(xì)胞被敲掉ETS2基因后,顯著減弱了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。7.使用Western Blot技術(shù)的檢測(cè)細(xì)胞中上皮標(biāo)志物,結(jié)果表明:Control組,NC組和siRNA-ETS2組的上皮標(biāo)志物E-cadherin的相對(duì)表達(dá)量分別為1.097±0.043,0.986 ±0.023和3.879±0.124,三組的上皮標(biāo)志物ZQ-1的相對(duì)表達(dá)量分別為 1.055±0.075,0.093±0.056 和 4.198±0.176,siRNA-ETS2 組和對(duì)照組相比,E-cadherin和ZQ-1的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。三組之間的間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的相對(duì)表達(dá)量為1.118±0.033,1.123±0.081和0.335±0.022,α-SMA 的相對(duì)表達(dá)量為 1.012±0.021,1.114±0.062 和 0.298士0.014,siRNA-ETS2組和對(duì)照組相比,其Vimentin及α-SMA的表達(dá)明顯下調(diào),其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。分析表明:抑制了 ETS2的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞通過(guò)增加E-cadherin,ZQ-1的表達(dá)和減少Vimentin和α-SMA的表達(dá)從而抑制了細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。8.使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)MAPK信號(hào)通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-ERK相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明:當(dāng)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞激活后,細(xì)胞中p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),但TGF-β +siRNA組的p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白和TGF-β組,TGF-β+NC組相比較而言,其升高程度受限,差異明顯(p0.01),研究證實(shí):ETS2被敲除后,會(huì)導(dǎo)致MAPK/p38/ERK/JNK的信號(hào)通路受到抑制,表明在TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中,ETS2通過(guò)MAPK信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:通過(guò)ETS2-siRNA轉(zhuǎn)染人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系從而敲除ETS2后,與對(duì)照組相比可誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞聚集于G0/G1期,顯著抑制細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)了 FaDu細(xì)胞的凋亡;通過(guò)抑制了 MAPK/p38/ERK/JNK的信號(hào)通路,抑制了細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程,從而減弱了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
【圖文】：

圖１：邋ＥＴＳ２免疫組化染色圖片逡逑Ａ：邋ＥＴＳ２在癌旁正常黏膜組織中的陰性表達(dá)（２００Ｘ）逡逑Ｂ：邋ＥＴＳ２在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)（２００Ｘ）逡逑Ｃ：邋ＥＴＳ２在癌旁正常黏膜組織中的陰性表達(dá)（４００Ｘ）逡逑Ｄ：邋ＥＴＳ２在腫瘤組織中的高表達(dá)（４００Ｘ）逡逑

圖２．邋ＥＴＳ２在腫瘤組織和癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)。逡逑Ａ：邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測(cè)ＥＴＳ２在ｍＲＮＡ水平的表達(dá)，與對(duì)照組相比，ＥＴＳ２邋ｍＲＮＡ逡逑水平在腫瘤組織樣本中表達(dá)顯著增高（Ｐ＜0．邋00１）；逡逑Ｂ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測(cè)ＥＴＳ２在蛋白水平的表達(dá)，與對(duì)照組相比，ＥＴＳ２蛋白逡逑水平在腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高（Ｐ＜0．邋00１）；逡逑Ｃ；邋ＥＴＳ２在蛋白水平的表達(dá)情況。逡逑５７逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳豪陽(yáng);王樹(shù)斌;曹選平;;轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Ets-1在口腔鱗癌中的表達(dá)及其意義[J];醫(yī)藥論壇雜志;2009年04期

2 ;Overexpression of ETS2 in human esophageal squamous cell carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2003年02期

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本文編號(hào)：2591454