發(fā)布時間：2020-03-19 08:32

【摘要】：第一部分姜黃素誘導(dǎo)hep2細(xì)胞凋亡進(jìn)程中死亡受體作用機(jī)制的實驗研究目的:我們在預(yù)實驗中已經(jīng)證實姜黃素能誘導(dǎo)人類喉癌hep2細(xì)胞的凋亡,本實驗擬證實姜黃素是否通過細(xì)胞凋亡外源性途徑之一的TRAIL信號通道的死亡受體起作用。方法:通過RT-PCR檢測TRAIL在hep2細(xì)胞中的表達(dá),運用western blot檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡前、后hep2細(xì)胞內(nèi)死亡受體DR4及死亡誘騙受體Dc R1和Dc R2的表達(dá)的變化,流式細(xì)胞儀Annexin-V細(xì)胞凋亡檢測法檢測TRAIL對hep2細(xì)胞調(diào)亡的影響。結(jié)果:TRAIL在hep2細(xì)胞中的有明顯表達(dá)(退火溫度55℃時無表達(dá))。隨著姜黃素誘導(dǎo)時間增加,hep2細(xì)胞凋亡不斷增多,但hep2細(xì)胞內(nèi)死亡受體DR4及死亡誘騙受體Dc R1和Dc R2的表達(dá)無明顯變化;用50nmol/L的TRAIL分別作用12h、24h、48h的hep2細(xì)胞與未經(jīng)處理的對照組hep2細(xì)胞鏡下觀察均無明顯細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果亦顯示50nmol/L的TRAIL作用12h、24h、48h對hep2細(xì)胞凋亡無明顯影響結(jié)論:通過本研究,發(fā)現(xiàn)人類喉癌hep2細(xì)胞為TRAIL抵抗細(xì)胞系,姜黃素能有效誘導(dǎo)其凋亡,但在凋亡誘導(dǎo)進(jìn)程中,TRAIL信號通道的相關(guān)受體表達(dá)無明顯變化,姜黃素可能通過其他凋亡途徑誘導(dǎo)hep2細(xì)胞凋亡。第二部分人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞線粒體DNA缺失對凋亡的影響背景與目的:建立人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞的無線粒體DNA(ρ0)細(xì)胞,探討人喉鱗狀細(xì)胞癌線粒體與凋亡的關(guān)系.方法:在細(xì)胞培養(yǎng)液中加50ng/ml EB、100ug/ml丙酮酸鈉、50ug/ml尿嘧啶進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)至獲得完全缺失mt DNA的細(xì)胞(ρ0細(xì)胞);用實時定量PCR技術(shù)檢測EB處理后30天的人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞mt DNA的拷貝數(shù);流式細(xì)胞儀檢測EB處理4天、8天、12天的hep2細(xì)胞經(jīng)姜黃素誘導(dǎo)凋亡后的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:成功建立了人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞的無線粒體DNA(ρ0)細(xì)胞,經(jīng)實時定量PCR檢測,EB刺激30天后ρ0-hep2細(xì)胞內(nèi)mt DNA的拷貝數(shù)為零;隨著細(xì)胞分裂mt DNA的不斷丟失,姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率逐漸減少。結(jié)論:mt DNA在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著一定調(diào)控作用。第三部分姜黃素促進(jìn)ROS觸發(fā)hep2凋亡機(jī)制的研究背景與目的:目前對癌癥的研究越來越深入,針對癌癥的藥物也越來越廣泛,但是仍然無法完全治愈癌癥。本研究旨在利用人喉鱗狀細(xì)胞癌hep2細(xì)胞,深入研究姜黃素在治療癌癥方面的作用機(jī)制,為臨床治療癌癥提供實驗依據(jù)。方法:建立mtDNA缺陷型細(xì)胞系,利用實時定量RT-PCR檢測ρ0-hep2細(xì)胞中的mt DNA的表達(dá);熒光酶標(biāo)儀檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基(ROS);以JC-1為探針染色法檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm);紫外分光光度計檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性(MPTP);Western Blot檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞中Cyto C的定位;酶標(biāo)儀檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞內(nèi)caspase 9活性;流式細(xì)胞儀檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細(xì)胞和正常hep2細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:線粒體缺陷(ρ0)hep2細(xì)胞比正常hep2細(xì)胞對姜黃素有更多的抵抗性;姜黃素處理后,mt DNA缺陷型hep2細(xì)胞產(chǎn)生的ROS產(chǎn)量相比較少;MPTP、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C以及caspase9活性檢測等實驗證明,姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞后,細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論:姜黃素通過調(diào)節(jié)ROS含量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文三、實驗結(jié)果（一）、RT-PCR 檢測 TRAIL 在 hep2 細(xì)胞中的表達(dá)情況為了明確 TRAIL（分子量 391bp）在 hep2 細(xì)胞中的表達(dá)情況，，我們采用 RT-PCR 進(jìn)行檢測。分別選用 5 個不同的退火溫度（49℃/52℃/55℃/58℃/61℃ ）進(jìn)行擴(kuò)增，其相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物 cDNA 和 mRNA 在瓊脂糖凝膠中電泳結(jié)果（Figure.1.1）表明 TRAIL 在 hep2 細(xì)胞中的有明顯表達(dá)(退火溫度 55℃時無表達(dá))。mRNA 電泳陰性結(jié)果排除了擴(kuò)增產(chǎn)物 cDNA 中基因組 DNA 污染。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文為了檢測姜黃素誘導(dǎo)凋亡后細(xì)胞內(nèi)死亡受體 DR4 的表達(dá)情況，我收集姜黃素作用不同時間長度（1h、3h、6h、12h、24h）后的 hep2 細(xì)采用 western blot 對細(xì)胞內(nèi)死亡受體 DR4 進(jìn)行定位檢測。結(jié)果表明隨誘導(dǎo)時間增加 hep2 細(xì)胞凋亡不斷增多，hep2 細(xì)胞內(nèi)死亡受體 DR4 的達(dá)無明顯變化（Figure.1.2）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.65

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本文編號：2589983