【摘要】：第一部分姜黃素誘導hep2細胞凋亡進程中死亡受體作用機制的實驗研究目的:我們在預實驗中已經(jīng)證實姜黃素能誘導人類喉癌hep2細胞的凋亡,本實驗擬證實姜黃素是否通過細胞凋亡外源性途徑之一的TRAIL信號通道的死亡受體起作用。方法:通過RT-PCR檢測TRAIL在hep2細胞中的表達,運用western blot檢測姜黃素誘導凋亡前、后hep2細胞內死亡受體DR4及死亡誘騙受體Dc R1和Dc R2的表達的變化,流式細胞儀Annexin-V細胞凋亡檢測法檢測TRAIL對hep2細胞調亡的影響。結果:TRAIL在hep2細胞中的有明顯表達(退火溫度55℃時無表達)。隨著姜黃素誘導時間增加,hep2細胞凋亡不斷增多,但hep2細胞內死亡受體DR4及死亡誘騙受體Dc R1和Dc R2的表達無明顯變化;用50nmol/L的TRAIL分別作用12h、24h、48h的hep2細胞與未經(jīng)處理的對照組hep2細胞鏡下觀察均無明顯細胞凋亡,流式細胞儀檢測結果亦顯示50nmol/L的TRAIL作用12h、24h、48h對hep2細胞凋亡無明顯影響結論:通過本研究,發(fā)現(xiàn)人類喉癌hep2細胞為TRAIL抵抗細胞系,姜黃素能有效誘導其凋亡,但在凋亡誘導進程中,TRAIL信號通道的相關受體表達無明顯變化,姜黃素可能通過其他凋亡途徑誘導hep2細胞凋亡。第二部分人喉鱗狀細胞癌Hep2細胞線粒體DNA缺失對凋亡的影響背景與目的:建立人喉鱗狀細胞癌Hep2細胞的無線粒體DNA(ρ0)細胞,探討人喉鱗狀細胞癌線粒體與凋亡的關系.方法:在細胞培養(yǎng)液中加50ng/ml EB、100ug/ml丙酮酸鈉、50ug/ml尿嘧啶進行連續(xù)傳代培養(yǎng)至獲得完全缺失mt DNA的細胞(ρ0細胞);用實時定量PCR技術檢測EB處理后30天的人喉鱗狀細胞癌細胞mt DNA的拷貝數(shù);流式細胞儀檢測EB處理4天、8天、12天的hep2細胞經(jīng)姜黃素誘導凋亡后的細胞凋亡情況。結果:成功建立了人喉鱗狀細胞癌Hep2細胞的無線粒體DNA(ρ0)細胞,經(jīng)實時定量PCR檢測,EB刺激30天后ρ0-hep2細胞內mt DNA的拷貝數(shù)為零;隨著細胞分裂mt DNA的不斷丟失,姜黃素誘導細胞凋亡率逐漸減少。結論:mt DNA在誘導細胞凋亡中起著一定調控作用。第三部分姜黃素促進ROS觸發(fā)hep2凋亡機制的研究背景與目的:目前對癌癥的研究越來越深入,針對癌癥的藥物也越來越廣泛,但是仍然無法完全治愈癌癥。本研究旨在利用人喉鱗狀細胞癌hep2細胞,深入研究姜黃素在治療癌癥方面的作用機制,為臨床治療癌癥提供實驗依據(jù)。方法:建立mtDNA缺陷型細胞系,利用實時定量RT-PCR檢測ρ0-hep2細胞中的mt DNA的表達;熒光酶標儀檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞內的活性氧自由基(ROS);以JC-1為探針染色法檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞內細胞線粒體膜電位(△Ψm);紫外分光光度計檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞內線粒體通透性(MPTP);Western Blot檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞中Cyto C的定位;酶標儀檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞內caspase 9活性;流式細胞儀檢測姜黃素誘導凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2細胞和正常hep2細胞細胞凋亡情況。結果:線粒體缺陷(ρ0)hep2細胞比正常hep2細胞對姜黃素有更多的抵抗性;姜黃素處理后,mt DNA缺陷型hep2細胞產(chǎn)生的ROS產(chǎn)量相比較少;MPTP、線粒體膜電位、細胞色素C以及caspase9活性檢測等實驗證明,姜黃素誘導細胞后,細胞發(fā)生凋亡。結論:姜黃素通過調節(jié)ROS含量誘導細胞凋亡。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文三、實驗結果（一）、RT-PCR 檢測 TRAIL 在 hep2 細胞中的表達情況為了明確 TRAIL（分子量 391bp）在 hep2 細胞中的表達情況，，我們采用 RT-PCR 進行檢測。分別選用 5 個不同的退火溫度（49℃/52℃/55℃/58℃/61℃ ）進行擴增，其相應擴增產(chǎn)物 cDNA 和 mRNA 在瓊脂糖凝膠中電泳結果（Figure.1.1）表明 TRAIL 在 hep2 細胞中的有明顯表達(退火溫度 55℃時無表達)。mRNA 電泳陰性結果排除了擴增產(chǎn)物 cDNA 中基因組 DNA 污染。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文為了檢測姜黃素誘導凋亡后細胞內死亡受體 DR4 的表達情況，我收集姜黃素作用不同時間長度（1h、3h、6h、12h、24h）后的 hep2 細采用 western blot 對細胞內死亡受體 DR4 進行定位檢測。結果表明隨誘導時間增加 hep2 細胞凋亡不斷增多，hep2 細胞內死亡受體 DR4 的達無明顯變化（Figure.1.2）。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.65

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本文編號：2589983