發(fā)布時間：2020-03-18 21:17

【摘要】：增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是繼發(fā)于孔源性視網(wǎng)膜脫離、嚴重的眼外傷或其修復(fù)術(shù)后發(fā)生的一種常見的難治性致盲性眼病。PVR及其引起的視網(wǎng)膜脫離是視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)后手術(shù)失敗的主要原因,發(fā)病率達5-10%。其發(fā)病機制包括:暴露于玻璃體腔的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial,RPE)及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖、移行、間質(zhì)轉(zhuǎn)化,在視網(wǎng)膜內(nèi)、外表面及玻璃體腔形成纖維細胞膜并向細胞外分泌膠原纖維,繼而纖維細胞膜收縮牽拉引起視網(wǎng)膜皺褶和脫離。PVR患者纖維細胞膜中細胞主要包含RPE、Müller/神經(jīng)膠質(zhì)細胞和成纖維細胞�？自葱砸暰W(wǎng)膜脫離發(fā)生以后,血-視網(wǎng)膜屏障破壞,RPE暴露于血清中細胞因子,從Bruch膜脫離,細胞間緊密連接破壞并丟失了上皮細胞形態(tài)。沒有細胞間緊密連接的抑制和在多種細胞因子的雙重作用下,RPE細胞發(fā)生增殖、遷移、間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)為成纖維細胞樣或肌成纖維樣細胞,表現(xiàn)為移行、侵襲能力增加,凋亡減少和表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)并分泌細胞外基質(zhì)。RPE細胞發(fā)生EMT在PVR纖維細胞膜的形成中起了非常重要的作用。目前,臨床上治療PVR的主要方法還是玻璃體切割術(shù)。但是PVR患者玻璃體切割術(shù)后即使視網(wǎng)膜復(fù)位,由于復(fù)發(fā)性視網(wǎng)膜脫離及PVR發(fā)病過程中對視網(wǎng)膜的損傷,使得術(shù)后視功能恢復(fù)有限。因此,修復(fù)視網(wǎng)膜脫離一個關(guān)鍵的目標就是預(yù)防PVR的發(fā)生發(fā)展。藥物防治PVR一直都受到廣泛的關(guān)注,但大多局限在基礎(chǔ)研究階段,進入到臨床試驗階段的藥物目前還不能夠有效的防治PVR。這就需要我們繼續(xù)尋找安全、高效的新藥。藏紅花酸(crocetin)又名番紅花酸或西紅花酸,來源于茜草科植物梔子果實,是藏紅花柱頭的主要有效成分之一,具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu),屬類胡蘿卜素物質(zhì)。它的化學(xué)式為C_(20)H_(24)O_4,分子量為328.4。除了具有抗腫瘤、抗凋亡、抗炎、抗纖維化的作用外,還能減輕缺血再灌注引起的視網(wǎng)膜損傷,具有多重生物學(xué)作用。我們推測藏紅花酸抑制細胞增殖、遷移、纖維化的生物學(xué)作用能夠同樣作用于PRE細胞,并抑制PVR的發(fā)生發(fā)展,同時能夠降低視網(wǎng)膜的損傷,保護視功能。因此,本研究首次將藏紅花酸應(yīng)用于PVR防治,擬以RPE細胞和兔眼PVR模型為研究對象,在細胞和體內(nèi)兩個層面上展開研究。在細胞層面觀察藏紅花酸對RPE細胞增殖、遷移的抑制作用,對TGF-β_2誘導(dǎo)發(fā)生EMT的RPE細胞的逆轉(zhuǎn)作用,并驗證其可能作用的分子機制。在體內(nèi)首先通過視網(wǎng)膜功能學(xué)及組織學(xué)的檢測驗證藏紅花酸玻璃體腔注射是否具有眼內(nèi)毒副作用;而后借助高效液相色譜分析得到藏紅花酸在玻璃體腔內(nèi)藥代動力學(xué)過程;最后通過玻璃體腔注藥,觀察藏紅花酸對兔眼PVR發(fā)生發(fā)展的抑制以及對視網(wǎng)膜的保護作用。為臨床應(yīng)用藏紅花酸防治PVR提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。第一部分藏紅花酸抑制體外培養(yǎng)的ARPE-19細胞增殖和遷移目的:觀察藏紅花酸對體外培養(yǎng)的ARPE-19細胞增殖和遷移能力的影響。方法:依據(jù)加入藏紅花酸藥物濃度不同,依次將ARPE-19細胞分為:對照組(0μM組)和實驗組(50μM組、100μM組、200μM組)。通過CCK-8實驗檢測藏紅花酸對ARPE-19細胞增殖活性的影響;流式細胞術(shù)分析藏紅花酸對ARPE-19細胞周期的影響;western blot檢測不同濃度藏紅花酸對ARPE-19細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、p53、p21表達的影響;劃痕實驗和Transwell小室兩種方法來驗證藏紅花酸對ARPE-19細胞遷移能力的影響。結(jié)果:藏紅花酸即使在低濃度(50μM)短時間(24h)內(nèi)對ARPE-19細胞增殖具有抑制作用(P0.05),而且這種抑制呈現(xiàn)濃度和時間依賴性;流式細胞術(shù)細胞周期分析表明藏紅花酸將細胞阻滯在G1期,使其無法進入S期而抑制細胞增殖;western blot蛋白檢測發(fā)現(xiàn)50μM藏紅花酸即能誘導(dǎo)細胞p53、p21表達升高(P0.05),200μM藏紅花酸能夠顯著升高p53及其下游蛋白p21的表達(P0.01)并抑制PCNA的表達(P0.01);劃痕實驗和Transwell小室結(jié)果一致,50μM藥物組對細胞遷移能力無影響,100μM和200μM藥物組細胞創(chuàng)傷愈合能力和穿膜細胞數(shù)量較對照組明顯下降。結(jié)論:藏紅花酸通過將ARPE-19細胞周期阻滯在G1期,上調(diào)p53及其下游p21的表達并抑制PCNA的表達來抑制細胞增殖,同時抑制ARPE-19細胞水平方向和垂直方向的遷移能力。第二部分藏紅花酸通過p38抑制TGF-β_2介導(dǎo)的ARPE-19細胞EMT目的:觀察藏紅花酸在體外能否抑制TGF-β_2介導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生EMT,并驗證可能的通路。方法:依據(jù)是否加入TGF-β_2和加入藏紅花酸藥物濃度不同,依次將ARPE-19細胞分為:陰性對照組、陽性對照組(10ng/mL TGF-β_2)、實驗組1(10ng/mL TGF-β_2+50μM藏紅花酸)、實驗組2(10ng/mL TGF-β_2+100μM藏紅花酸)、實驗組3(10ng/mL TGF-β_2+200μM藏紅花酸)。RT-qPCR、western blot和細胞免疫熒光雙染色驗證EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。應(yīng)用p38 MAPK抑制劑SB203580觀察藏紅花酸是否通過p38MAPK來抑制TGF-β_2介導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生EMT。結(jié)果:加入10ng/mL TGF-β_2刺激48小時后,ARPE-19細胞由鵝卵石樣典型上皮細胞形態(tài)延展增大變?yōu)殚L梭形,100μΜ和200μM藏紅花酸能夠抵抗TGF-β_2引起細胞形態(tài)改變,維持細胞的上皮形態(tài);RT-q PCR和western blot結(jié)果表明ARPE-19細胞高表達上皮細胞標記物ZO-1和E-cadherin,低表達間質(zhì)細胞標記物α-SMA和Vimentin,加入TGF-β_2刺激后,ARPE-19細胞發(fā)生EMT,ZO-1和E-cadherin表達明顯減少,α-SMA和Vimentin表達明顯升高,50μΜ-200μΜ藏紅花酸均能抑制TGF-β_2介導(dǎo)的上皮細胞和間質(zhì)細胞標記物蛋白表達水平的改變,并呈現(xiàn)出濃度依賴性;對陰性對照組、陽性對照組及200μΜ藏紅花酸組進行細胞免疫熒光雙染,結(jié)果與前面一致;10μΜSB203580預(yù)處理ARPE-19細胞能夠阻斷TGF-β_2引起的p38的磷酸化,并抑制α-SMA的表達,藏紅花酸同樣能夠抑制TGF-β_2引起的ARPE-19細胞p38的磷酸化,并呈現(xiàn)濃度依賴性,說明藏紅花酸能夠通過影響p38的活化來抑制TGF-β_2誘導(dǎo)的ARPE-19細胞發(fā)生EMT。結(jié)論:藏紅花酸能夠抑制p38 MAPK的活化來拮抗TGF-β_2誘導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生EMT。第三部分藏紅花酸兔眼玻璃體腔注射眼內(nèi)毒副作用研究目的:通過觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的變化來評估藏紅花酸玻璃體腔注射的安全性。方法:選用8只色素兔,右眼為實驗眼,注射0.2μmol藏紅花酸(4只)或0.4μmol藏紅花酸0.1ml(4只),左眼為對照眼,注射含對應(yīng)DMSO濃度的0.1ml PBS。所有實驗動物在注射前與注射后1、3、5、7、14天行裂隙燈和間接眼底鏡檢查。在注射前和注射后第7、14天進行特殊眼科檢查:眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)和全視野視網(wǎng)膜電圖(full-field clinical electroretinography,ffERG)。玻璃體腔注藥后14天,眼科檢查完畢,摘取眼球制作組織病理切片,行HE染色觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性。結(jié)果:剔除一只發(fā)生玻璃腔積血的實驗眼和一只因注射時損傷晶狀體后囊致白內(nèi)障的對照眼,其余對照眼裂隙燈及間接眼底鏡檢查無異常,實驗眼在注射后第1天出現(xiàn)輕度玻璃體混濁,第3天恢復(fù)清亮,裂隙燈檢查無異常;注射后14天,OCT及病理學(xué)檢查顯示實驗眼和對照眼的視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整清晰,無視網(wǎng)膜水腫、出血及萎縮;對比注射前、注射后第7、14天ffERG結(jié)果顯示:在暗適應(yīng)及明適應(yīng)條件下,對照眼及實驗眼的a波、b波振幅均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:0.4μmol藏紅花酸及其以下劑量的玻璃體腔注射對色素兔眼部組織結(jié)構(gòu)及功能無損害。第四部分藏紅花酸在正常兔眼玻璃體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究目的:應(yīng)用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定0.4μmol藏紅花酸色素兔玻璃腔注射后不同時間點的藥物濃度及其藥代動力學(xué)參數(shù)。方法:建立測定玻璃體中藏紅花酸濃度的HPLC方法:設(shè)定色譜條件;建立玻璃體樣品處理方法;建立標準曲線;對處理方法進行回收率、精密度測試。選用14只色素兔,雙眼均注射0.4μmol藏紅花酸眼內(nèi)注射液,并于注射后即刻、1、3、7、12、24、48和72h分別處死實驗動物2只,小心摘取4只眼球,獲得完整的玻璃體,按上述建立的HPLC方法進行標本的處理和檢測,得到每個時間點玻璃體腔藏紅花酸藥物濃度,建立藥-時曲線,并進行藥代動力學(xué)參數(shù)計算。結(jié)果:在選定色譜條件下,色素兔玻璃體上清液和玻璃體沉淀中內(nèi)源性物質(zhì)對藏紅花酸及內(nèi)標姜黃素的測定無干擾,藏紅花酸和姜黃素分離完全,峰形良好,出峰時間分別在8.30min和4.79min。在選定色譜條件下,色素兔玻璃體上清液中藏紅花酸濃度的標準曲線方程為y=0.0686x-0.0021,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996,玻璃體沉淀中藏紅花酸濃度的標準曲線方程為y=0.0069x-0.0015,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。低、中、高三個不同濃度的藏紅花酸模擬玻璃體上清樣品的提取回收率及日間、日內(nèi)精密度符合實驗要求。低、中、高三個不同濃度的藏紅花酸模擬玻璃體沉淀樣品的提取回收率及日間、日內(nèi)精密度符合實驗要求。依據(jù)標準曲線方程計算各時間點對應(yīng)玻璃體上清藏紅花酸藥物濃度和玻璃體沉淀未溶解的藏紅花酸質(zhì)量,并建立藥-時曲線,應(yīng)用DAS 3.0軟件采用非房室模型分析藥代動力學(xué)參數(shù)顯示,0.4μmol藏紅花酸玻璃體腔注射后1h達到最大藥物濃度36.77±3.39μg/mL(111.98±10.33μM),其半衰期為4.23±1.31h。結(jié)論:建立了測定色素兔玻璃體藏紅花酸濃度的HPLC方法,該方法專屬性強,穩(wěn)定性好,回收率及精密度高;0.4μmol藏紅花酸玻璃體腔注射后1h達到最大藥物濃度36.77±3.39μg/mL(111.98±10.33μM),分布容積為3±0.11ml,清除率為0.1±0.02ml/h,半衰期為4.23±1.31h。第五部分藏紅花酸防治兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的實驗研究目的:觀察藏紅花酸玻璃體腔注射能否抑制色素兔PVR的發(fā)生發(fā)展。方法:選用20只色素兔,隨機分為實驗組和對照組,每組10只,對右眼進行操作。實驗組右眼在PVR造模的同時注入預(yù)先配制的0.4μmol藏紅花酸,對照組右眼在PVR造模的同時注入0.1ml PBS(含2%DMSO)。實驗動物分別于造模前、造模后3、7、14、28行裂隙燈、間接眼底鏡、眼底照相、OCT及ffERG檢查。根據(jù)眼底檢查情況,按Fastenberg分級法在造模后第7、14、28天進行PVR分級。并于造模后28天摘取模型眼行大體標本照相后進行組織病理學(xué)檢查:HE染色觀察視網(wǎng)膜組織的病理變化、Masson染色觀察膠原纖維蛋白沉積情況、免疫組織化學(xué)觀察α-SMA表達情況。結(jié)果:根據(jù)造模后第7、14、28天眼底檢查情況,將各組實驗動物依據(jù)Fastenberg分級并進行Mann-Whitney U檢驗:在造模后第7天實驗組及對照組PVR分級無統(tǒng)計學(xué)差異;造模后第14天,實驗組0級有3只,1級有6只,2級有1只,對照組1級有5只,2級有4只,3級有1只,對照組較實驗組病情進展更快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019);造模后第28天,實驗組1級有3只,2級有5只,3級有2只,對照組2級有3只,3級有3只,4級有2只,5級有2只,實驗組未出現(xiàn)廣泛視網(wǎng)膜脫離及更嚴重的視網(wǎng)膜漏斗狀脫離,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。OCT顯示:造模后對照組玻璃體混濁更明顯,于第7天玻璃體腔已經(jīng)形成致密的增殖膜,第28天,視網(wǎng)膜出現(xiàn)廣泛脫離并可見視網(wǎng)膜裂孔和皺褶;實驗組造模后玻璃體混濁較輕,第28天可見網(wǎng)膜前增殖膜牽拉視網(wǎng)膜隆起,髓線抬高,放射狀有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)模糊。ffERG顯示:在造模后第28天,對照組ERG波形幾乎消失,實驗組明暗適應(yīng)條件下a波、b波振幅輕度下降。病理學(xué)檢查顯示:對照組玻璃體腔增殖膜及視網(wǎng)膜前膜更致密,膠原纖維及α-SMA表達呈強陽性,視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)混亂;實驗組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對整齊,視網(wǎng)膜前膜及玻璃體腔增殖膜單薄,膠原纖維及α-SMA表達呈弱陽性。結(jié)論:藏紅花酸能夠抑制色素兔PVR的進展,并減少玻璃體及視網(wǎng)膜前增殖膜的形成,保護視功能。
【圖文】：

圖 1 藏紅花酸抑制 ARPE-19 細胞增殖Fig. 1 Crocetin inhibits ARPE-19 cell proliferation as determined by thCCK-8 assay.PE-19 cells were untreated or treated with different concentrations ofcetin (50, 100, and 200 μM) for 24, 48, and 72 h. Absorbance at 450 nmowed a significant decrease in the growth of crocetin-treated cells compth that in the control cells in a dose- and time- dependent manner. *P< 0P< 0.01, ***P< 0.001. The data are presented as the mean ±S.D. (n =roup).

圖 2 藏紅花酸阻滯 ARPE-19 細胞周期Fig. 2 Crocetin induces cell cycle arrest by flow cytometric analysis.ARPE-19 cells were harvested after treatment with or without 50 and 100 μMcrocetin for 24 h. DNA was stained with PI for flow cytometric analysis. Thenumber of cells in G1 phase was significantly increased in the crocetin-treatedgroup compared with that in the untreated group.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R774.1

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊敬奎;;建德市藏紅花產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J];杭州農(nóng)業(yè)與科技;2009年03期

2 本刊編輯部;王忠壯;沈一萍;;紅色金子 藏紅花[J];食品與生活;2018年09期

3 王風(fēng)秀;汪云;梅夏齊;楊培青;王媛媛;;藏紅花酸抗小鼠肝纖維化的實驗研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2017年28期

4 逯鵬;王佳森;姜善紅;李愛群;姚寶洪;王占青;施真;;藏紅花酸預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制探討[J];山東醫(yī)藥;2017年46期

5 馬洪亮;吳奇林;李銳;莫東升;肖友檢;;藏紅花酸乙酯的合成研究[J];香料香精化妝品;2011年02期

6 柴旦,薛全福,斯勤,苗會,莊逢源,張叔倫;藏紅花酸對缺氧大鼠肺血液動力學(xué)和血液流變學(xué)的影響[J];中國病理生理雜志;1992年05期

7 楊培青;汪云;梅夏齊;王風(fēng)秀;;藏紅花酸對TGF-β1刺激的人肝星狀細胞LX-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2018年17期

8 張曉麗;劉洪海;杜平;張希波;;藏紅花酸的研究進展[J];西北藥學(xué)雜志;2008年06期

9 張愛貴;羅娟;;藏紅花酸二醛的合成研究（英文）[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2016年08期

10 陳達林;;藏紅花酸對力竭運動大鼠血脂和血液生化指標的影響[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2010年16期

相關(guān)會議論文 前1條

1 馬洪亮;吳奇林;;藏紅花酸乙酯的合成研究[A];第八屆中國香料香精學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王會芳;藏紅花酸對增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的抑制作用及分子機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

2 于洋;梔子抗老年癡呆活性成分研究[D];沈陽藥科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 柴峰華;高產(chǎn)藏紅花酸釀酒酵母菌株的構(gòu)建與優(yōu)化[D];天津大學(xué);2017年

2 梅雪昂;產(chǎn)藏紅花酸的人工酵母細胞的構(gòu)建[D];天津大學(xué);2016年

3 趙永吉;藏紅花酸對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮的保護作用[D];南昌大學(xué);2017年

4 方志凱;類胡蘿卜素物質(zhì)及其中間體的合成與性能研究[D];江南大學(xué);2007年

，

本文編號：2589200