【摘要】：第一部分miR-632在喉癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2生物學(xué)特性的影響目的:本部分旨在研究miR-632在喉癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的影響。方法:收集并篩選了 10例喉癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。培養(yǎng)了正常人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)和喉癌細(xì)胞系(SNU899、TU212和Hep-2)。使用miR-632 mimics、miR-632 mimics negative control、miR-632 inhibitor、miR-632 inhibitor negative control分別轉(zhuǎn)染了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞,并依次將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為 NC-mimics 組、miR-632 mimics 組、NC-inhibitor 組、miR-632 inhibitor組。使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了組織及細(xì)胞中miR-632的表達(dá)。使用MTT法檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。使用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的克隆形成能力。使用Western blot檢測(cè)了細(xì)胞中cyclin D1和c-myc蛋白的表達(dá)。使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的遷移能力。使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:相較于癌旁組織,喉癌腫瘤組織中miR-632的相對(duì)表達(dá)量顯著更高(P0.01);與 BEAS-2B 細(xì)胞相比,喉癌細(xì)胞系 SNU899、TU212 和 Hep-2 中 miR-632的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P0.01),且Hep-2細(xì)胞系中miR-632的相對(duì)表達(dá)量明顯最高。與NC-mimics組相比,miR-632 mimics組細(xì)胞的OD560值顯著更高(P0.01)、克隆形成數(shù)量顯著更高(P0.01)、cyclin D1和c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.01)、遷移細(xì)胞百分比顯著更高(P0.01)、細(xì)胞侵襲百分比顯著更高(P0.01)。而相較于inhibitor-NC組,miR-632 inhibitor組細(xì)胞的OD560值顯著更低(P0.01)、克隆形成數(shù)量顯著更低(P0.01)、cyclinD1和c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.01)、遷移細(xì)胞百分比顯著更低(P0.01)、細(xì)胞侵襲百分比顯著更低(P0.01)。結(jié)論:miR-632在喉癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),其上調(diào)后促進(jìn)了 Hep-2細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。第二部分GSK3β在喉癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2生物學(xué)特性的影響目的:本部分旨在研究GSK3β在喉癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的影響。方法:使用GSK3β siRNA及其陰性對(duì)照鏈轉(zhuǎn)染了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞,并分別將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為si-NC組、si-GSKββ組。使用qRT-PCR檢測(cè)了細(xì)胞中GSK3β mRNA的表達(dá)。使用Westernblot分析檢測(cè)了細(xì)胞中GSK3β蛋白的表達(dá)。使用MTT法檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。使用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的克隆形成能力。使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的遷移能力。使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:相較于癌旁組織,GSK3βmRNA在喉癌腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P0.01);且與BEAS-2B細(xì)胞相比,喉癌細(xì)胞系(SNU899、TU212和Hep-2)中GSK3β mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P0.01),且Hep-2細(xì)胞系中GSK3βmRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著最低。與si-NC組相比,si-GSK3β組細(xì)胞的OD560值顯著更高(P0.01)、細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著更高(P0.01)、遷移細(xì)胞百分比顯著更高(P0.01)、細(xì)胞侵襲百分比顯著更高(P0.01)。結(jié)論:GSK3β在喉癌組織和細(xì)胞中下調(diào),其下調(diào)后促進(jìn)了 Hep-2細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。第三部分miR-632通過(guò)靶向調(diào)控GSK3β表達(dá)影響喉癌細(xì)胞Hep-2的生物學(xué)特性目的:本部分旨在研究miR-632與GSK3β之間的靶向關(guān)系,及其影響Hep-2細(xì)胞殖、遷移及侵襲的作用機(jī)制。方法:通過(guò)Target Scan在線預(yù)測(cè)了 miR-632與GSK3β之間的靶向關(guān)系。使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了 miR-632與GSK3β之間的靶向性。分別使用miR-632 inhibitor negative control 及GSK3β siRNA 陰性對(duì)照鏈、miR-632 inhibitor及 GSK3βsiRNA 陰性對(duì)照鏈、miR-632 inhibitor 及 GSK3β siRNA 共轉(zhuǎn)染了 Hep-2 細(xì)胞,并分組如下:NC-inhibitor + si-NC 組、miR-632 inhibitor + si-NC 組、miR-632 inhibitor+ si-GSK3β組。使用qRT-PCR檢測(cè)了細(xì)胞中GSK3β mRNA的表達(dá)。通過(guò)Western blot技術(shù)分析了細(xì)胞中GSK3β蛋白的表達(dá)。使用MTT法檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。使用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的克隆形成能力。使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的遷移能力。使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:Target Scan在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明GSK3β是miR-632的靶基因,兩者的結(jié)合位點(diǎn)位于3'UTR區(qū)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明GSK3β是miR-632的下游靶基因。相較于 NC-mimics 組,miR-632 mimics 組 Hep-2 細(xì)胞中 GSK3β mRNA 及蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P0.01),而與NC-inhibitor組相比較,miR-632 inhibitor組Hep-2細(xì)胞中GSK3β mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P0.01)。Pearson相關(guān)性分析顯示,miR-632的相對(duì)表達(dá)量與喉癌組織中GSK3βmRNA的相對(duì)表達(dá)量之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。相較于NC-inhibitor+ si-NC組,miR-632 inhibitor+si-NC組Hep-2細(xì)胞的OD560值顯著下降(P0.01)、克隆形成數(shù)量顯著更低(P0.01)、遷移細(xì)胞百分比顯著更低(P0.01)、侵襲細(xì)胞百分比顯著下降(P0.01);而 miR-632 inhibitor + si-GSK3β組細(xì)胞的 OD560 值、克隆形成數(shù)量、遷移細(xì)胞百分比、侵襲細(xì)胞百分比均顯著高于miR-632 inhibitor +si-NC組(P0.01),且與NC-inhibitor + si-NC組之間的差異并不明顯。結(jié)論:miR-632通過(guò)靶向負(fù)向調(diào)控GSK3β表達(dá)影響Hep-2細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。
【圖文】：

圖２－２轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中ｍｉＲ－６３２的相對(duì)表達(dá)逡逑－－－－

圖２－ｌ邋ｍｉＲ－６３２在喉癌組織及喉癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)逡逑－ｍ－
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2589103