【摘要】：研究背景:早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是一種可引起嬰幼兒視力損害的致盲性眼病,增生的視網(wǎng)膜新生血管是其重要病理特征。除低出生孕周、低體重以及過度氧療外,炎癥在ROP的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜組織中定居的單核巨噬細(xì)胞,主要參與免疫、炎癥及損傷修復(fù)過程,并在視網(wǎng)膜血管的發(fā)育以及新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用。本研究組前期研究證實(shí),炎癥能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞并促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的生成,但具體機(jī)制尚不明確。Caspase-1作為一種重要的蛋白水解酶,能夠剪切、釋放成熟的IL-1β、IL-18,是炎癥信號(hào)通路中的核心分子之一。它在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型視網(wǎng)膜組織中表達(dá)升高,可在體外參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,并可通過其下游分子參與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的視網(wǎng)膜新生血管性疾病的病理過程。但Caspase-1是否通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞,參與OIR中視網(wǎng)膜新生血管的生成,則有待于進(jìn)一步研究。研究目的:探討在小鼠OIR中,Caspase-1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞參與視網(wǎng)膜新生血管生成的調(diào)控作用及其可能的機(jī)制。研究方法:一、小鼠OIR動(dòng)物模型相關(guān)研究:1.動(dòng)物分組:7日齡(P7)新生小鼠隨機(jī)分為常氧組、OIR組和OIR+VX-765組,常氧組在常氧環(huán)境中飼養(yǎng),其余兩組構(gòu)建OIR模型;P12-P16,OIR+VX-765組和OIR組分別每天腹腔注射Caspase-1抑制劑VX-765和等量0.4%聚乙二醇(VX-765溶劑)。2.體重測(cè)量:在P12-P17,測(cè)量常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠的體重。3.免疫熒光染色:使用視網(wǎng)膜組織冰凍切片進(jìn)行Caspase-1與Iba-1的免疫熒光染色,分別檢測(cè)P12、P17的常氧組、OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1的表達(dá)和活化小膠質(zhì)細(xì)胞的分布;并檢測(cè)P17的常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。4.Western blot:P12、P17的常氧組、OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織提取總蛋白,檢測(cè)Caspase-1、p20、IL-1β、VEGF的表達(dá)水平;P17的常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠視網(wǎng)膜組織,提取蛋白后檢測(cè)TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達(dá)水平。5.視網(wǎng)膜鋪片染色:分別于P12、P17制作全視網(wǎng)膜鋪片行Lectin染色,觀察驗(yàn)證OIR模型構(gòu)建情況,并比較P17時(shí)常氧組、OIR組和OIR+VX-765組間視網(wǎng)膜無血管區(qū)以及新生血管面積的大小。二、培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究:1.細(xì)胞分組:培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧組及抑制劑組,抑制劑組和缺氧組分別經(jīng)VX-765和0.4%聚乙二醇預(yù)處理3h后,缺氧條件下培養(yǎng)24h;對(duì)照組常規(guī)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間。常規(guī)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞系RF/6A細(xì)胞。2.Western blot:提取各組BV-2細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)Caspase-1、p20、TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達(dá)水平。3.管腔形成實(shí)驗(yàn):提取各組BV-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液,作為條件培養(yǎng)基孵育RF/6A細(xì)胞,測(cè)量完整管腔形成長(zhǎng)度。4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):提取各組BV-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液,作為條件培養(yǎng)基孵育Transwell小室中培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞,計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。5.免疫熒光染色:對(duì)各組BV-2細(xì)胞進(jìn)行Caspase-1和Iba-1免疫熒光染色,觀察Caspase-1的表達(dá)以及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。6.RT-PCR:提取各組BV-2細(xì)胞的總RNA,檢測(cè)Iba-1的轉(zhuǎn)錄水平。7.ELISA:提取各組BV-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液,檢測(cè)IL-1β的蛋白濃度。研究結(jié)果:一、小鼠OIR動(dòng)物模型相關(guān)研究:1.OIR模型構(gòu)建:小鼠經(jīng)氧誘導(dǎo)處理后,視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示,各時(shí)間點(diǎn)常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管走行正常,均勻分布;P12,OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央存在大片無血管區(qū);P17,OIR組小鼠視網(wǎng)膜仍有無血管區(qū),并有視網(wǎng)膜新生血管出現(xiàn)。提示,小鼠OIR模型構(gòu)建成功。2.OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1的表達(dá)、活化小膠質(zhì)細(xì)胞的分布及相關(guān)分子的表達(dá)變化:免疫熒光結(jié)果顯示,Caspase-1在常氧組小鼠視網(wǎng)膜組織中表達(dá)較弱,在OIR模型中表達(dá)增強(qiáng),且P17強(qiáng)于P12,主要集中分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層,并與活化小膠質(zhì)細(xì)胞的分布有明確的共定位。Western blot結(jié)果顯示,Caspase-1及其活性形式p20、IL-1β、VEGF在常氧組視網(wǎng)膜中表達(dá)量較低,在OIR模型中表達(dá)量顯著增加(P12d0.0001;P17d0.0001);從變化趨勢(shì)看,常氧組P17與P12間無明顯差異(P0.05),OIR組各蛋白的表達(dá)P17較P12明顯增強(qiáng)(P0.05)。3.Caspase-1對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響:在P12-P17,OIR組小鼠體重明顯低于常氧組(P0.05),OIR+VX-765組小鼠體重顯著低于常氧組(P0.05),而OIR組小鼠體重與OIR+VX-765組之間沒有明顯差異(P0.05)。4.Caspase-1對(duì)OIR小鼠視網(wǎng)膜無血管區(qū)及新生血管面積的影響:視網(wǎng)膜鋪片Lectin染色結(jié)果顯示,P17時(shí)常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管化完全,分布均勻,形態(tài)規(guī)則,發(fā)育良好,未見明顯無血管區(qū)及視網(wǎng)膜新生血管;OIR組視網(wǎng)膜無血管區(qū)和新生血管面積百分比分別為(16.58±1.14)%、(4.00±0.41)%;OIR+VX-765組兩者均明顯減少,分別為(12.23±1.02)%和(2.16±0.52)%(P0.01)。5.Caspase-1對(duì)OIR小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響:免疫熒光結(jié)果顯示,P17時(shí),常氧組小鼠視網(wǎng)膜中少見活化的小膠質(zhì)細(xì)胞;OIR組中活化小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,主要分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層;OIR+VX-765組中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞較OIR組明顯減少,只在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有少量分布。6.Caspase-1對(duì)OIR小鼠視網(wǎng)膜組織TLR4信號(hào)通路及VEGF表達(dá)的影響:Western blot結(jié)果顯示,常氧組小鼠視網(wǎng)膜中TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α和VEGF表達(dá)量低,OIR組表達(dá)均明顯增高(P0.05),OIR+VX-765組除了Caspase-1前體,其余分子表達(dá)均較OIR組明顯下降(P0.05)。二、培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究:1.各組BV-2細(xì)胞中Caspase-1及其活性水平的表達(dá)變化:Western blot結(jié)果顯示,對(duì)照組BV-2細(xì)胞中Caspase-1及其活化形式表達(dá)量較低,缺氧組兩者表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05),而抑制劑組Caspase-1變化不明顯(P0.05),其活性水平較缺氧組顯著下降(P0.05)。2.小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A管腔形成的影響:正常對(duì)照組形成的管腔少,設(shè)定管腔形成相對(duì)長(zhǎng)度為100,常規(guī)條件培養(yǎng)基組則為162±5,而經(jīng)缺氧組BV-2培養(yǎng)液處理后明顯增多,為271±12,加入Caspase-1抑制劑后又明顯減少為171±22,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A遷移的影響:正常對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)量少,為112±22,條件培養(yǎng)基組增加為179±24,經(jīng)缺氧組BV-2培養(yǎng)液處理后顯著增加,為347±34,加入抑制劑后明顯減少,為212±27,均存在顯著差異(P0.05)。4.缺氧條件下Caspase-1對(duì)培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響:免疫熒光結(jié)果顯示,對(duì)照組BV-2細(xì)胞Caspase-1、Iba-1信號(hào)弱,表達(dá)量少,缺氧組中兩者表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05),而抑制劑組中兩者表達(dá)均顯著下降(P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組BV-2細(xì)胞Iba-1表達(dá)低,缺氧后表達(dá)增強(qiáng),而抑制劑處理后轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào),統(tǒng)計(jì)學(xué)均有顯著差異(P0.05)。5.Caspase-1對(duì)缺氧條件下小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β的影響:ELISA結(jié)果顯示,對(duì)照組BV-2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β蛋白濃度為(137±28)pg/ml,缺氧組中蛋白濃度顯著升高,為(459±47)pg/ml,加入抑制劑后蛋白水平下降,為(302±39)pg/ml,均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.Caspase-1對(duì)缺氧條件下小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和血管生成相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響:Western blot結(jié)果顯示,對(duì)照組BV-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達(dá)水平較低,缺氧后各分子表達(dá)顯著增強(qiáng),加入抑制劑后各分子表達(dá)水平下降,差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:Caspase-1能夠通過調(diào)控OIR小鼠模型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,進(jìn)而參與視網(wǎng)膜新生血管的生成,其作用機(jī)制可能與Caspase-1受TLR4信號(hào)激活,調(diào)控下游炎癥效應(yīng)分子IL-1β、TNF-α的表達(dá),并釋放VEGF相關(guān)。
【圖文】：

-32- 1 P12、P17 常氧組及 OIR 組小鼠視網(wǎng)膜鋪片 Lectin 染色結(jié)果圖（標(biāo)尺=500μ：P12，常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)形態(tài)規(guī)則，覆蓋全視網(wǎng)膜；B：P12，OIR 組小網(wǎng)膜血管化不完全，視網(wǎng)膜中央可見大片的無血管區(qū)（白色線條環(huán)繞區(qū)域）；7，常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管密度增加；D：P17，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張，視中央仍有無血管區(qū)，中周部可見大量新生血管芽（黃色標(biāo)記）。

-33-圖 2.P12、P17 常氧組及 OIR 組小鼠視網(wǎng)膜組織 Caspase-1、Iba-1 免疫熒光染色結(jié)果圖（標(biāo)尺=50μm）。Caspase-1 呈紅色熒光；Iba-1 標(biāo)記活化 MG，呈綠色熒光。A：P12，常氧組小鼠視網(wǎng)膜組織中 Caspase-1 表達(dá)不明顯，活化 MG 數(shù)量較少，散在分布于外叢狀層和神經(jīng)纖維層；B：P12，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達(dá)略有增加，Iba-1 染色陽性的活化 MG 增多；C：P17，，常氧組視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達(dá)仍不顯著，活化 MG 數(shù)量少；D：P17，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達(dá)顯著增強(qiáng)，活化 MG 數(shù)量明顯增多，主要分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層，兩者有明確的共染現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：2587591