【摘要】：研究背景:早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是一種可引起嬰幼兒視力損害的致盲性眼病,增生的視網(wǎng)膜新生血管是其重要病理特征。除低出生孕周、低體重以及過度氧療外,炎癥在ROP的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。小膠質細胞是視網(wǎng)膜組織中定居的單核巨噬細胞,主要參與免疫、炎癥及損傷修復過程,并在視網(wǎng)膜血管的發(fā)育以及新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用。本研究組前期研究證實,炎癥能夠激活小膠質細胞并促進視網(wǎng)膜新生血管的生成,但具體機制尚不明確。Caspase-1作為一種重要的蛋白水解酶,能夠剪切、釋放成熟的IL-1β、IL-18,是炎癥信號通路中的核心分子之一。它在氧誘導視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型視網(wǎng)膜組織中表達升高,可在體外參與小膠質細胞的活化,并可通過其下游分子參與小膠質細胞相關的視網(wǎng)膜新生血管性疾病的病理過程。但Caspase-1是否通過調控小膠質細胞,參與OIR中視網(wǎng)膜新生血管的生成,則有待于進一步研究。研究目的:探討在小鼠OIR中,Caspase-1對小膠質細胞參與視網(wǎng)膜新生血管生成的調控作用及其可能的機制。研究方法:一、小鼠OIR動物模型相關研究:1.動物分組:7日齡(P7)新生小鼠隨機分為常氧組、OIR組和OIR+VX-765組,常氧組在常氧環(huán)境中飼養(yǎng),其余兩組構建OIR模型;P12-P16,OIR+VX-765組和OIR組分別每天腹腔注射Caspase-1抑制劑VX-765和等量0.4%聚乙二醇(VX-765溶劑)。2.體重測量:在P12-P17,測量常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠的體重。3.免疫熒光染色:使用視網(wǎng)膜組織冰凍切片進行Caspase-1與Iba-1的免疫熒光染色,分別檢測P12、P17的常氧組、OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1的表達和活化小膠質細胞的分布;并檢測P17的常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠視網(wǎng)膜中小膠質細胞的活化情況。4.Western blot:P12、P17的常氧組、OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織提取總蛋白,檢測Caspase-1、p20、IL-1β、VEGF的表達水平;P17的常氧組、OIR組和OIR+VX-765組小鼠視網(wǎng)膜組織,提取蛋白后檢測TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達水平。5.視網(wǎng)膜鋪片染色:分別于P12、P17制作全視網(wǎng)膜鋪片行Lectin染色,觀察驗證OIR模型構建情況,并比較P17時常氧組、OIR組和OIR+VX-765組間視網(wǎng)膜無血管區(qū)以及新生血管面積的大小。二、培養(yǎng)小膠質細胞及血管內(nèi)皮細胞相關研究:1.細胞分組:培養(yǎng)小膠質細胞系BV-2細胞分為對照組、缺氧組及抑制劑組,抑制劑組和缺氧組分別經(jīng)VX-765和0.4%聚乙二醇預處理3h后,缺氧條件下培養(yǎng)24h;對照組常規(guī)條件下培養(yǎng)相同時間。常規(guī)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞系RF/6A細胞。2.Western blot:提取各組BV-2細胞總蛋白,檢測Caspase-1、p20、TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達水平。3.管腔形成實驗:提取各組BV-2細胞培養(yǎng)上清液,作為條件培養(yǎng)基孵育RF/6A細胞,測量完整管腔形成長度。4.細胞遷移實驗:提取各組BV-2細胞培養(yǎng)上清液,作為條件培養(yǎng)基孵育Transwell小室中培養(yǎng)的RF/6A細胞,計數(shù)遷移細胞數(shù)量。5.免疫熒光染色:對各組BV-2細胞進行Caspase-1和Iba-1免疫熒光染色,觀察Caspase-1的表達以及小膠質細胞的活化情況。6.RT-PCR:提取各組BV-2細胞的總RNA,檢測Iba-1的轉錄水平。7.ELISA:提取各組BV-2細胞培養(yǎng)上清液,檢測IL-1β的蛋白濃度。研究結果:一、小鼠OIR動物模型相關研究:1.OIR模型構建:小鼠經(jīng)氧誘導處理后,視網(wǎng)膜鋪片結果顯示,各時間點常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管走行正常,均勻分布;P12,OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央存在大片無血管區(qū);P17,OIR組小鼠視網(wǎng)膜仍有無血管區(qū),并有視網(wǎng)膜新生血管出現(xiàn)。提示,小鼠OIR模型構建成功。2.OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1的表達、活化小膠質細胞的分布及相關分子的表達變化:免疫熒光結果顯示,Caspase-1在常氧組小鼠視網(wǎng)膜組織中表達較弱,在OIR模型中表達增強,且P17強于P12,主要集中分布于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層,并與活化小膠質細胞的分布有明確的共定位。Western blot結果顯示,Caspase-1及其活性形式p20、IL-1β、VEGF在常氧組視網(wǎng)膜中表達量較低,在OIR模型中表達量顯著增加(P12d0.0001;P17d0.0001);從變化趨勢看,常氧組P17與P12間無明顯差異(P0.05),OIR組各蛋白的表達P17較P12明顯增強(P0.05)。3.Caspase-1對小鼠生長的影響:在P12-P17,OIR組小鼠體重明顯低于常氧組(P0.05),OIR+VX-765組小鼠體重顯著低于常氧組(P0.05),而OIR組小鼠體重與OIR+VX-765組之間沒有明顯差異(P0.05)。4.Caspase-1對OIR小鼠視網(wǎng)膜無血管區(qū)及新生血管面積的影響:視網(wǎng)膜鋪片Lectin染色結果顯示,P17時常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管化完全,分布均勻,形態(tài)規(guī)則,發(fā)育良好,未見明顯無血管區(qū)及視網(wǎng)膜新生血管;OIR組視網(wǎng)膜無血管區(qū)和新生血管面積百分比分別為(16.58±1.14)%、(4.00±0.41)%;OIR+VX-765組兩者均明顯減少,分別為(12.23±1.02)%和(2.16±0.52)%(P0.01)。5.Caspase-1對OIR小鼠視網(wǎng)膜小膠質細胞活化的影響:免疫熒光結果顯示,P17時,常氧組小鼠視網(wǎng)膜中少見活化的小膠質細胞;OIR組中活化小膠質細胞明顯增多,主要分布于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層;OIR+VX-765組中活化的小膠質細胞較OIR組明顯減少,只在神經(jīng)節(jié)細胞層有少量分布。6.Caspase-1對OIR小鼠視網(wǎng)膜組織TLR4信號通路及VEGF表達的影響:Western blot結果顯示,常氧組小鼠視網(wǎng)膜中TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α和VEGF表達量低,OIR組表達均明顯增高(P0.05),OIR+VX-765組除了Caspase-1前體,其余分子表達均較OIR組明顯下降(P0.05)。二、培養(yǎng)小膠質細胞及血管內(nèi)皮細胞相關研究:1.各組BV-2細胞中Caspase-1及其活性水平的表達變化:Western blot結果顯示,對照組BV-2細胞中Caspase-1及其活化形式表達量較低,缺氧組兩者表達明顯增強(P0.05),而抑制劑組Caspase-1變化不明顯(P0.05),其活性水平較缺氧組顯著下降(P0.05)。2.小膠質細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞RF/6A管腔形成的影響:正常對照組形成的管腔少,設定管腔形成相對長度為100,常規(guī)條件培養(yǎng)基組則為162±5,而經(jīng)缺氧組BV-2培養(yǎng)液處理后明顯增多,為271±12,加入Caspase-1抑制劑后又明顯減少為171±22,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.小膠質細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞RF/6A遷移的影響:正常對照組的遷移細胞數(shù)量少,為112±22,條件培養(yǎng)基組增加為179±24,經(jīng)缺氧組BV-2培養(yǎng)液處理后顯著增加,為347±34,加入抑制劑后明顯減少,為212±27,均存在顯著差異(P0.05)。4.缺氧條件下Caspase-1對培養(yǎng)小膠質細胞活性的影響:免疫熒光結果顯示,對照組BV-2細胞Caspase-1、Iba-1信號弱,表達量少,缺氧組中兩者表達明顯增強(P0.05),而抑制劑組中兩者表達均顯著下降(P0.05)。RT-PCR結果顯示,對照組BV-2細胞Iba-1表達低,缺氧后表達增強,而抑制劑處理后轉錄明顯下調,統(tǒng)計學均有顯著差異(P0.05)。5.Caspase-1對缺氧條件下小膠質細胞分泌IL-1β的影響:ELISA結果顯示,對照組BV-2細胞培養(yǎng)液中IL-1β蛋白濃度為(137±28)pg/ml,缺氧組中蛋白濃度顯著升高,為(459±47)pg/ml,加入抑制劑后蛋白水平下降,為(302±39)pg/ml,均存在顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。6.Caspase-1對缺氧條件下小膠質細胞炎癥和血管生成相關細胞因子表達的影響:Western blot結果顯示,對照組BV-2細胞中TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表達水平較低,缺氧后各分子表達顯著增強,加入抑制劑后各分子表達水平下降,差異均存在統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:Caspase-1能夠通過調控OIR小鼠模型小膠質細胞的活化,進而參與視網(wǎng)膜新生血管的生成,其作用機制可能與Caspase-1受TLR4信號激活,調控下游炎癥效應分子IL-1β、TNF-α的表達,并釋放VEGF相關。
【圖文】：

-32- 1 P12、P17 常氧組及 OIR 組小鼠視網(wǎng)膜鋪片 Lectin 染色結果圖（標尺=500μ：P12，常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)形態(tài)規(guī)則，覆蓋全視網(wǎng)膜；B：P12，OIR 組小網(wǎng)膜血管化不完全，視網(wǎng)膜中央可見大片的無血管區(qū)（白色線條環(huán)繞區(qū)域）；7，常氧組小鼠視網(wǎng)膜血管密度增加；D：P17，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜血管擴張，視中央仍有無血管區(qū)，中周部可見大量新生血管芽（黃色標記）。

-33-圖 2.P12、P17 常氧組及 OIR 組小鼠視網(wǎng)膜組織 Caspase-1、Iba-1 免疫熒光染色結果圖（標尺=50μm）。Caspase-1 呈紅色熒光；Iba-1 標記活化 MG，呈綠色熒光。A：P12，常氧組小鼠視網(wǎng)膜組織中 Caspase-1 表達不明顯，活化 MG 數(shù)量較少，散在分布于外叢狀層和神經(jīng)纖維層；B：P12，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達略有增加，Iba-1 染色陽性的活化 MG 增多；C：P17，，常氧組視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達仍不顯著，活化 MG 數(shù)量少；D：P17，OIR 組小鼠視網(wǎng)膜中 Caspase-1 表達顯著增強，活化 MG 數(shù)量明顯增多，主要分布于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層，兩者有明確的共染現(xiàn)象。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R774.1

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本文編號：2587591