【摘要】：目的： 建立有效、可控、簡便、重復(fù)性好的彌散性低劑量532nm激光眼損傷動物模型。觀察致傷生物效應(yīng)，得出量效關(guān)系，并探討可能的分子機(jī)制。方法： 采用相應(yīng)激光器和自制裝置造模，將實驗動物按時間點分為照射后即刻、1d、3d、5d、7d和14d組。用直接眼底鏡、彩色眼底照相、FFA觀察受照后實驗動物的眼底改變，行視網(wǎng)膜電流圖檢查，HE染色、超微電鏡觀察組織學(xué)變化，TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡，免疫組化、常規(guī)RT-PCR和實時定量RT-PCR觀察神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的變化。 結(jié)果： 1、建立了無肉眼可見的損傷的、彌散性532nm激光照射的動物模型。此模型中眼底照相及眼底血管熒光造影均未見異常。 2、視網(wǎng)膜電流圖5項檢查顯示，隨照射時間的增加，暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)b波振幅明顯降低，，與正常對照組有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（P0.05）；暗適應(yīng)眼的最大混合反應(yīng)a、b波潛伏期延長，振幅降低（P0.05）；振蕩電位無明顯變化（P0.05）；明適應(yīng)視錐細(xì)胞反應(yīng)a、b波振幅明顯降低（P0.05）。 3、HE染色顯示，正常對照組的各時點之間ONL厚度的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），除受照后即刻以外，其余各時點ONL厚度與正常對照組相比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 4、電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，隨著照射時間的延長，外節(jié)盤膜結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)分解、碎裂及空泡變，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹呈球形變。外核層細(xì)胞核排列紊亂，核膜皺縮，核染色質(zhì)固縮凝集、溶解、空泡變，出現(xiàn)凋亡小體。 5、TUNEL染色顯示，陽性的細(xì)胞幾乎都位于外核層。于激光照射第1d外核層開始出現(xiàn)，第3d、5d、7d、14d陽性細(xì)胞數(shù)量接近，但由于外核層持續(xù)變薄，凋亡指數(shù)呈上升趨勢，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（P＜0.05），各組間比較亦有差異（P＜0.05）。 6、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkA、TrkB、TrkC和P75NTR的免疫組化顯示，在正常大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層，光感受器和色素上皮層均有基礎(chǔ)量表達(dá)，傷后不同時間點TrkA和TrkB在視網(wǎng)膜各層的表達(dá)無明顯差異；而TrkC和P75NTR在各層視網(wǎng)膜組織中表達(dá)量明顯增加，而在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)和視網(wǎng)膜色素上皮層的表達(dá)增加尤為明顯。受照后3d，5d表達(dá)量持續(xù)增高，各時間點P75NTR在視網(wǎng)膜內(nèi)節(jié)的表達(dá)與外節(jié)之間有明顯的分界線，在受照后14d組，這種分界尤為明顯。 7、常規(guī)RT-PCR和實時定量RT-PCR均顯示：視網(wǎng)膜P75NTR表達(dá)明顯增加，在激光損傷后24小時開始表達(dá)，3天表達(dá)明顯升高，并隨著照射時間的延長，在7天、14天有更高的表達(dá)；TrkA、TrkB在視網(wǎng)膜中的表達(dá)在各時間點無明顯差異；而可以與NT-3、NT-4/5結(jié)合的TrkC的表達(dá)量隨照射時間延長持續(xù)升高。 結(jié)論： 1、本研究建立了有效的、可控制的、簡便易行、重復(fù)性好的低劑量激光重復(fù)輻照致眼損傷的動物模型。 2、在低功率和低能量密度的彌散性532nm激光作用下，以每日照射2次，每次連續(xù)照射1小時的頻率，連續(xù)照射2周，并未對大鼠的視網(wǎng)膜造成肉眼可見的損傷。 3、造模組視網(wǎng)膜電生理活動減弱，且減弱程度與照射時間的延長密切相關(guān)。提示在低劑量激光重復(fù)照射致眼損傷的臨床診斷及對預(yù)后的評估中，眼電生理檢查應(yīng)被列為重要的一項輔助檢查。受照7d至14d為激光眩目眼損傷致傷效應(yīng)的平臺期。 4、隨著照射時間的延長，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層變薄進(jìn)行性加重，而非壞死性的細(xì)胞凋亡是這種視網(wǎng)膜激光損傷模型感光細(xì)胞減少的主要機(jī)制，并以視網(wǎng)膜的外核層細(xì)胞凋亡為主。 5、P75NTR在低劑量彌散性532nm激光所導(dǎo)致的光感受器的凋亡過程中，起著促進(jìn)感光細(xì)胞損傷的作用。而TrkC作為拮抗P75NTR作用的一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，在激光輻照視網(wǎng)膜導(dǎo)致?lián)p傷的過程中則發(fā)揮了抑制感光細(xì)胞凋亡、保護(hù)視網(wǎng)膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)的作用。
【圖文】：

3.討論：

解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文于 Wistar 大鼠的頭部近似三角形，其角膜緣平面與地面不垂直因此動物臺與支架之間設(shè)置了萬向關(guān)節(jié)相連，以便于調(diào)整動物與刺激器之間的角度，使角膜緣平面與刺激器平行。麻醉對動物的體溫調(diào)節(jié)有影響，溫度變化會對電生理結(jié)果產(chǎn)生影響，因此為獲得滿意的實驗結(jié)果本實驗配備動物保溫裝置。根據(jù)本實驗室的經(jīng)驗和習(xí)慣，角膜電極采用金制鉤狀角膜接觸電極，參考電極及接地電極均采用針狀電極，分別放置于被測眼外眥皮下和大鼠的尾部。充分利用輔助裝置可以使視覺電生理實驗操作簡便、規(guī)范并能夠減輕動物痛苦提高結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性[24, 25]。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R779.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅燦嶠;梁英杰;吳惠群;鐘覺民;梁惠珍;;小鼠眼球標(biāo)本固定液及制片方法的改進(jìn)[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2007年01期

2 柳志忠;;激光武器的最新發(fā)展技術(shù)[J];艦船電子工程;2010年09期

3 胡東東;楊在富;王嘉睿;陳虹霞;陳鵬;張成崗;;脈沖1064 nm激光視網(wǎng)膜損傷動物模型的建立[J];激光生物學(xué)報;2011年01期

4 張作明,顧永昊,郭群,龍?zhí)?李莉,石力,侯豹可;小鼠與大鼠視網(wǎng)膜電圖和閃光視覺誘發(fā)電位記錄標(biāo)準(zhǔn)化方案建議[J];眼科新進(jìn)展;2004年02期

5 王曉英;單清;馬萍;陳鵬;郭啟煜;錢煥文;;神經(jīng)生長因子對激光致視網(wǎng)膜損傷后bFGF蛋白表達(dá)的影響[J];眼科研究;2007年04期

6 瞿文生,袁本利,余壽忠;大鼠眼球標(biāo)本石蠟制片方法的改進(jìn)[J];中華病理學(xué)雜志;1999年04期

本文編號：2583603