【摘要】：眩暈是常見的臨床癥狀之一,是因平衡系統(tǒng)(包括視覺、本體感覺和前庭系統(tǒng))功能紊亂所導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性或位置性錯(cuò)覺。椎-基底動(dòng)脈供血不足是老年性眩暈發(fā)作的最主要的病因之一。椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)短暫缺血發(fā)作(vertebral-basilarartery insufficiency, VBI)指的是由于大腦后循環(huán)中血流量下降引起的一系列暫時(shí)性的臨床癥狀,可出現(xiàn)一過性眩暈、視物障礙、聽力下降及平衡失調(diào)等。其中,椎-基底動(dòng)脈供血不足性眩暈(vertebrobasilarin sufficient vertigo, VBIV)為首要且最常見的臨床表現(xiàn),因其發(fā)病率高、發(fā)作急驟且病因復(fù)雜,對(duì)患者的工作及生活質(zhì)量可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此,該疾病的診斷與治療一直困擾著臨床醫(yī)生,已成為臨床干預(yù)及科研研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)課題。目前治療眩暈的方法雖多,但療效欠佳。究其原因可能是眩暈的確切機(jī)制尚缺乏較為深入的闡述,尤其關(guān)于離子通道對(duì)VBIV中前庭神經(jīng)神經(jīng)元電生理活動(dòng)的作用所知甚少。因此,進(jìn)一步探討眩暈相關(guān)的神經(jīng)學(xué)發(fā)生機(jī)制是提高診斷和療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 前庭系統(tǒng)是人體平衡系統(tǒng)中的關(guān)鍵構(gòu)成部分之一,其功能是處理視覺和位置的平衡。前庭神經(jīng)復(fù)合核(vestibular nuclear complex, VNC)是腦干中最大的神經(jīng)核,也是前庭神經(jīng)系統(tǒng)的中繼站和前庭信號(hào)的主要換元站。而在前庭神經(jīng)復(fù)合核中,前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核(medial vestibular nucleus, MVN)因其解剖結(jié)構(gòu)獨(dú)特,并且具有重要的神經(jīng)電生理作用,已經(jīng)成為探討與眩暈機(jī)制研究的首選核團(tuán)。前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元對(duì)缺氧、缺血刺激尤為敏感。然而,缺氧對(duì)前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性異常的根本的機(jī)制尚未確定。前庭系統(tǒng)的功能與前庭核神經(jīng)元電生理特性密切相關(guān),深入研究其電生理調(diào)控機(jī)制對(duì)闡明眩暈相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。 大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Big-conductance Ca2+-activated potassium channels, BKCa)具有高電導(dǎo)、電壓依賴性強(qiáng)、對(duì)鈣離子敏感性高以及獨(dú)特的藥理作用等特點(diǎn),在生物系統(tǒng)中起到重要的作用。BKCa廣泛分布于多種可興奮性細(xì)胞中,并可呈現(xiàn)出陽性高表達(dá)。BKCa的功能異常可導(dǎo)致聽力損失、高血壓病、哮喘和腦部缺血等疾病的發(fā)生,并且在某些疾病中是具有潛在臨床意義的藥物作用靶點(diǎn)。BKCa是細(xì)胞膜電位的關(guān)鍵調(diào)控元件,可因細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加和膜電位的去極化而被激活。BKCa一個(gè)關(guān)鍵作用是通過改變動(dòng)作電位幅度和放電頻率而調(diào)控神經(jīng)元的興奮性。阻滯BKCa會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的過度興奮,而前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元可以自發(fā)性地和誘發(fā)性地誘發(fā)神經(jīng)元的動(dòng)作電位。激活BKCa可能發(fā)揮著一個(gè)“緊急閘”的作用：一方面,BKCa通過抑制細(xì)胞膜的去極化以及大量的Ca2+的流入而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。另一方面,BKCa阻滯劑可能通過減少K+外流過多而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。BKCa通道中α亞單位的結(jié)構(gòu)和功能有其獨(dú)有的特性,而且,BKCa的功能與α亞單位的表達(dá)關(guān)系緊密。然而,目前尚不清楚缺氧后前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的BKCa及BKCa通道α亞單位的表達(dá)。 BKCa對(duì)缺氧/缺血性損傷情況下的神經(jīng)細(xì)胞電生理活動(dòng)也產(chǎn)生了關(guān)鍵的作用。缺氧和缺血損傷可對(duì)大腦產(chǎn)生危害,因它們均具有降低組織中氧的可用性的特性,這就決定了其高代謝率。已有研究報(bào)道,Na+通道、Ca2+通道、小電導(dǎo)Ca2+-激活K+通道(SK通道)和大電導(dǎo)Ca2+-激活的K+通道(BK通道)均存在于前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元細(xì)胞中。但是,目前尚不是很清楚阻滯BKCa通道能否作為前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元抵御缺氧性損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。因此,探討B(tài)KCa對(duì)缺氧誘導(dǎo)的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性異常的作用尤為緊迫。 為了解決以上問題,我們采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、半定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和免疫組化技術(shù)(immunohistochemistry,IHC),探討缺氧導(dǎo)致的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元神經(jīng)異常放電活動(dòng)以及BKCa對(duì)其缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性異常所發(fā)揮的作用。該研究將進(jìn)一步為治療椎-基底動(dòng)脈供血不足性眩暈提供理論學(xué)依據(jù),為有效防治提供新思路和藥物作用的新靶點(diǎn)。 目的 本研究通過檢測(cè)缺氧刺激引起的小鼠腦切片前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中神經(jīng)興奮性異常活動(dòng),以及BKCa的阻滯是否對(duì)其缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性異常產(chǎn)生影響。旨在探討B(tài)KCa在前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元缺氧損傷引起的神經(jīng)元興奮性異常中扮演的角色,從而闡明BKCa通道是否在缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用并揭示其可能的作用機(jī)制。 方法 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用的是6-9周大小的雄性C57BL/6小鼠。小鼠前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元置于含5%CO2～95%N2(V/V)混合氣體的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中進(jìn)行缺氧孵育,以構(gòu)建小鼠前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元缺氧損傷動(dòng)物模型。 1.運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)含氧量正常組與缺氧組中前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中原癌基因c-Fos的表達(dá)情況； 2.運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)含氧量正常組與缺氧組中前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa通道α亞單位的表達(dá)情況； 3.運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗方法記錄缺氧刺激對(duì)前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞放電活性的影響； 4.予以選擇性BKCa誘導(dǎo)劑NS1619預(yù)處理后,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄激活BKCa對(duì)缺氧誘導(dǎo)的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電活性的影響； 5.予以BKCa通道特異性阻滯劑IBTX (iberiotoxin)預(yù)處理后,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄在缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元細(xì)胞中的總K+外向電流和BKCa電流； 6.運(yùn)用半定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa mRNA表達(dá)水平。 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中c-Fos蛋白的表達(dá)情況 C-Fos在缺氧組(5%O2)和正常含氧量組(21%O2)前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)神經(jīng)元細(xì)胞核中均存在一定的陽性表達(dá)。在正常含氧量小鼠腦切片前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中,我們觀察到神經(jīng)元c-Fos陽性表達(dá)較少見。相比之下,置于缺氧ACSF孵育1h后,小鼠腦切片前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中觀察到的c-Fos陽性表達(dá)顯著增加(P0.05)。 2.缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa通道α亞單位的表達(dá)情況 BKCa通道α亞單位在缺氧組和正常含氧量組前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)神經(jīng)元中均存在陽性表達(dá)。在正常氧量組的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中,我們觀察到大量BKCa通道α亞單位呈現(xiàn)出陽性表達(dá)。而且與正常含氧量組相比,缺氧孵育1h后BKCa通道a亞單位陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P0.05)。 3.缺氧對(duì)前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性的影響 缺氧刺激后可引起前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元異常興奮性的變化。缺氧預(yù)處理10min后,前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的放電現(xiàn)象首先顯示增多,然后減少直至消失；與此同時(shí),缺氧處理10min后可引起前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的靜息膜電位的去極化的幅值降低。 4. BKCa激活對(duì)缺氧誘導(dǎo)的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性異常的影響 NS1619預(yù)處理可影響缺氧刺激下誘導(dǎo)的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性異�；钚浴Ｓ�10μM NS1619預(yù)孵育2-4h后,并且置于在缺氧條件下10min后,在前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中可觀察到典型的膜電位去極化的幅值降低(P0.05)。NS1619預(yù)處理能顯著延長(zhǎng)3min缺氧刺激所致的所致神經(jīng)元損傷的最大反應(yīng)時(shí)間(P0.05); NS1619預(yù)處理能減少3min缺氧條件下的神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的增幅。但對(duì)缺氧10min條件下誘導(dǎo)的神經(jīng)元的動(dòng)作電位增幅沒有顯著的影響(P0.05); NS1619預(yù)處理能降低缺氧10min刺激后前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元細(xì)胞靜息電位的去極化幅值(P0.05),但缺氧3min刺激對(duì)的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元細(xì)胞膜電位的去極化幅值無明顯影響(P0.05)。 5.缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa電流的變化 與正常含氧量腦組織相比,置于缺氧ACSF孵育10min后前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中總K+外向電流顯著減少(P0.05),而且缺氧組前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa電流也顯著減少(P0.05)。 6.缺氧前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa mRNA表達(dá)水平的變化 與正常含氧量組相比較,置于缺氧ACSF中孵育10min后的的前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中BKCa mRNA水平顯著下降(P0.05)。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)急性缺氧損傷后,前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元神經(jīng)元興奮性異�；顒�(dòng)增加,而且,阻滯BKCa通道可引起缺氧后前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性異常的暫時(shí)性增強(qiáng)。這些結(jié)果提示,BKCa通道可能在眩暈患者前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核抵御缺氧損傷中扮演了一個(gè)重要的神經(jīng)保護(hù)角色,可能作為一個(gè)潛在地治療VBI引起的眩暈發(fā)作、聽力損失的作用靶點(diǎn)。該研究將進(jìn)一步為臨床有效防治提供新的思路和藥物作用的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.4

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本文編號(hào)：2581128