【摘要】：第一部分RMVECs的培養(yǎng)與鑒定及RMVECs缺氧模型的建立 目的：分離、培養(yǎng)、鑒定小鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(RMVECs),建立RMVECs缺氧模型,并評估該模型的有效性。 方法：原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞取材于C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜,用Ⅷ因子相關(guān)抗原進行細胞鑒定。3-6代小鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于厭氧袋中構(gòu)建缺氧模型。缺氧時間設(shè)為0.5、1、2、3、12、24、48及72小時。血氣分析各時間點細胞培養(yǎng)液的pO2, pCO2及pH,對該模型進行評估。 結(jié)果：Ⅷ因子相關(guān)抗原法鑒定視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞陽性率為90%。當(dāng)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞在厭氧袋中培養(yǎng)2小時,血氣分析結(jié)果顯示p02為5.60Kpa, pC02為6.04Kpa,pH為7.07;當(dāng)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞在厭氧袋中培養(yǎng)大于2小時,血氣分析結(jié)果顯示p02為4.5Kpa, pCO2和pH無明顯變化。 結(jié)論：采用組織塊貼壁法成功培養(yǎng)出小鼠RMVECs.厭氧袋培養(yǎng)RMVECs可以有效建立RMVECs的缺氧模型,該方法簡單有效。 第二部分CREB小干擾RNA對缺氧誘導(dǎo)的RMVECs增殖產(chǎn)生影響 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞中的CREB基因沉默,觀察其對RMVECs增殖的影響并探討可能的機制。 方法：利用RNA干擾技術(shù),設(shè)計構(gòu)建針對CREB基因siRNA慢病毒載體,將此CREB特異性siRNA序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入RMVECs,同時設(shè)立空載對照。觀察時間設(shè)為12、24、48、72、96h。轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡觀察。實驗分為四組：常氧組,缺氧模型組,缺氧+siRNA組,缺氧+空載體組。采用MTT法檢測各組細胞增殖能力。應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)和免疫印跡法(Western Blot)檢測各組不同時間點CREB、AKtmRNA及蛋白表達水平。 結(jié)果：CREBsiRNA慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)的RMVECs后,48小時可見少量綠色熒光蛋白,轉(zhuǎn)染72h后表達熒光細胞逐漸增多、強度增強,96h開始下降。轉(zhuǎn)染72h后轉(zhuǎn)染效率為70%。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-TimePCR)和免疫印跡法(Western Blot)均顯示CREB-siRNA慢病毒載體能有效特異地降低RMVECs中CREB的表達。MTT法檢測各組細胞增殖結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72小時后缺氧+siRNA組細胞增殖率明顯低于其它3組(p0.05);缺氧模型組與缺氧+空載體組無明顯差異(p0.05)。轉(zhuǎn)染72小時后缺氧+siRNA組CREB、AKtmRNA及蛋白表達水平明顯低于缺氧模型組及缺氧+空載體組(p0.05);缺氧模型組與缺氧+空載體組CREB、AKtmRNA水平無明顯差異(p0.05)。 結(jié)論：CREB靶向siRNA在體外能特異性及有效地抑制缺氧誘導(dǎo)的RMVECs中CREBmRNA及蛋白的表達,最佳轉(zhuǎn)染時間為轉(zhuǎn)染后72小時。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的RMVECs中,CREB沉默可以抑制缺氧誘導(dǎo)的RMVECs增殖并誘導(dǎo)凋亡,這種作用可能與抑制PI3K/AKt信號通路的表達有關(guān)。 第三部分CREB在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型的表達研究 目的：通過氧環(huán)境的變化誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生新生血管,建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。探討CREB在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的表達及其意義。 方法：將186只7日齡C57BL/6J小鼠隨機分成正常對照組和誘導(dǎo)模型組。正常對照組置于正常環(huán)境溫度下飼養(yǎng)；誘導(dǎo)模型組置于氧濃度為(75±2)%的密閉環(huán)境中飼養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)移至正常環(huán)境溫度下再飼養(yǎng)5天,建立OR模型。取兩組17日齡小鼠眼球做石蠟包埋切片,行HE染色并計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目；取兩組17日齡小鼠應(yīng)用視網(wǎng)膜熒光血管造影觀察視網(wǎng)膜血管的形態(tài)學(xué)變化和新生血管的形成。分別于7日齡、9日齡、12日齡、14日齡、17日齡和21日齡將兩組小鼠處死,用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)和免疫印跡法(Western Blot)分別檢測CREB在正常對照組視網(wǎng)膜和誘導(dǎo)模型組視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的表達情況。 結(jié)果：視網(wǎng)膜熒光血管造影鋪片結(jié)果顯示在誘導(dǎo)模型組小鼠視網(wǎng)膜中有大量新生血管生成,其結(jié)構(gòu)和分布紊亂;HE染色計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目誘導(dǎo)模型組與正常對照組相比,數(shù)量明顯增加且差異具有顯著性(P0.01)。Real-Time PCI法和Western Blot法顯示在誘導(dǎo)模型組視網(wǎng)膜新生血管形成過程中CREB的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高,與正常對照組的差異均具有顯著性(P0.05;p0.05),并且CREB的表達變化與視網(wǎng)膜新生血管的形成呈正相關(guān)的趨勢。 結(jié)論：研究結(jié)果表明在OIR小鼠模型中CREB呈明顯高表達,并且CREB的表達變化與視網(wǎng)膜新生血管的形成呈正相關(guān)的趨勢。CREB有可能是治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的新靶點。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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