【摘要】：下咽癌（hypopharyngeal carcinoma）惡性度較高，鄰近擴(kuò)散、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都較早。下咽癌的病理分型以下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngealsquamous cell carcinoma，HPSCC）最多見(jiàn)。因?yàn)榘l(fā)病部位隱蔽，下咽癌很難早期發(fā)現(xiàn)，且易沿粘膜下擴(kuò)散，臨床發(fā)現(xiàn)的時(shí)候很多已經(jīng)達(dá)到中晚期，能夠接受手術(shù)的病例非常有限，大約只在60%左右，五年生存率大約為20%-40%。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展，診療設(shè)備、外科手術(shù)和放化療等綜合診療手段在不斷改進(jìn)，但在最近的二十余年里HPSCC的五年生存率并沒(méi)有明顯的改善和提高。開(kāi)發(fā)和應(yīng)用更加有效的腫瘤治療手段，尋求更加有效的治療策略對(duì)提高HPSCC的治療水平至關(guān)重要。 已經(jīng)證實(shí)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，分子生物學(xué)機(jī)制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因而越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注于基因治療，試圖從腫瘤的發(fā)生根源尋找遏制腫瘤的方法。人們理想的基因治療是可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度來(lái)調(diào)節(jié)治療基因在特定器官內(nèi)的表達(dá)水平。但是在基因治療領(lǐng)域如何對(duì)特定基因定時(shí)、定量地調(diào)控并研究其不同表達(dá)水平下的作用是一個(gè)難題。依賴于熱休克蛋白、激素或重金屬等的傳統(tǒng)基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)，存在著高本底、多嗜效應(yīng)和環(huán)境污染等缺陷，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。Gossen等創(chuàng)建的基因開(kāi)關(guān)系統(tǒng)，又稱為四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)開(kāi)關(guān)系統(tǒng)（Tet-on/off系統(tǒng)）克服了傳統(tǒng)誘導(dǎo)系統(tǒng)的不足。這種系統(tǒng)是通過(guò)原核大腸桿菌Tnol轉(zhuǎn)座子調(diào)控元件，在真核細(xì)胞中定量并特異地控制外源基因表達(dá)的體系。該系統(tǒng)被認(rèn)為是目前最理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，具有高效、特異、嚴(yán)密等特點(diǎn)，在基因功能和治療等領(lǐng)域已被國(guó)內(nèi)、外學(xué)者廣泛地應(yīng)用。但是，尚未有HPSCC方面的相關(guān)研究報(bào)道。 TNF-α(tumor necrosis factor-α，以下簡(jiǎn)稱TNF)于30年前被發(fā)現(xiàn)，是到目前為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒作用。TNF既能直接殺死腫瘤細(xì)胞，又能通過(guò)激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。它的最顯著的活性特征是可以在體內(nèi)外特異的殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。但是，由于TNF在體內(nèi)的半衰期較短，低劑量的應(yīng)用抗腫瘤效果不太顯著，甚至在某些腫瘤，還有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，要達(dá)到療效水平，需持續(xù)大劑量注射，這通常會(huì)引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、頭痛、休克等全身癥狀，臨床應(yīng)用的效果不太理想，大大限制了TNF的使用范圍。 TNF主要通過(guò)與兩個(gè)受體：TNF受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）和TNF受體2（tumor necrosis factor receptor2，TNFR2）結(jié)合來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用。這兩類受體均由信號(hào)肽、胞漿結(jié)構(gòu)區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)和胞外結(jié)構(gòu)區(qū)組成。兩類受體的胞外區(qū)同源性為28%，胞內(nèi)區(qū)沒(méi)有同源性，提示兩類受體介導(dǎo)的是不同的信號(hào)傳遞通路。TNFR1可產(chǎn)生兩種相反的作用效應(yīng)，它既可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF的毒性效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死，又可以通過(guò)激活NF-κB促進(jìn)增殖。TNFR2也具有兩種作用途徑，它既可以增強(qiáng)TNFR1引起的凋亡，又可獨(dú)立誘導(dǎo)凋亡，還可以促進(jìn)增殖。兩種受體在什么情況下選擇哪種通路，仍不完全清楚。有研究表明在細(xì)胞表面TNFR的表達(dá)水平變化可以改變細(xì)胞對(duì)TNF的敏感性，細(xì)胞表面的TNFR數(shù)目越高，對(duì)TNF的細(xì)胞毒性作用就越敏感，而對(duì)TNF作用不敏感的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞表面的TNF受體缺如或幾乎觀察不到，受體數(shù)目與腫瘤細(xì)胞敏感性呈正相關(guān)。可見(jiàn)，TNFR對(duì)機(jī)體的TNF作用具有重要的調(diào)節(jié)作用。 TNF與多種化療藥物具有協(xié)同作用。經(jīng)研究表明TNF與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)軟組織肉瘤、黑色素瘤、胃癌、肺癌等多種腫瘤的化療效果。但是尚未有相關(guān)的研究在頭頸部腫瘤中開(kāi)展。并且，TNF與化療藥物協(xié)同作用的機(jī)理及調(diào)控機(jī)制未完全清楚。不管其確切的機(jī)制如何，在下咽癌的治療過(guò)程中，如何提高腫瘤的殺傷作用并同時(shí)減少TNF和化療藥物的用量，，是腫瘤治療的核心問(wèn)題。腫瘤細(xì)胞的TNFR表達(dá)水平對(duì)這一協(xié)同作用可能具有重要影響，與其相關(guān)的研究可能具有重要意義。 本研究用免疫組化和Western blot的方法檢測(cè)TNFR1和TNFR2在HPSCC組織中的表達(dá)，分析TNFR表達(dá)與HPSCC臨床病理因素的關(guān)系。通過(guò)慢病毒構(gòu)建利用基因開(kāi)關(guān)系統(tǒng)穩(wěn)定高表達(dá)人TNFR2基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系。研究TNF、順鉑（cisplatin，DDP）及二者聯(lián)合作用對(duì)TNFR正常表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞增殖、凋亡的影響。觀察當(dāng)用中和抗體阻斷TNFR1的作用、利用基因開(kāi)關(guān)系統(tǒng)高表達(dá)TNFR2后、以及同時(shí)阻斷TNFR1作用、高表達(dá)TNFR2后，TNF、DDP作用后，細(xì)胞系增殖、凋亡情況的變化，分析TNFR表達(dá)變化與TNF、DDP敏感性的關(guān)系，探討下咽癌的TNF、DDP治療抵抗與TNFR表達(dá)水平之間的關(guān)系，為臨床減少化療藥物的用量，提高下咽癌的治療水平提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。研究分為三部分： 第一部分TNFR在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系 目的：檢測(cè)TNFR1和TNFR2在HPSCC組織中的表達(dá)，并且與臨床諸病理因素進(jìn)行相關(guān)分析，探討TNFR的表達(dá)與HPSCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 方法： 1用免疫組織化學(xué)SP染色的方法檢測(cè)45例HPSCC組織及配對(duì)癌旁下咽粘膜組織中TNFR1和TNFR2的表達(dá)，并與臨床病理因素進(jìn)行分析。 2Western blot檢測(cè)3例HPSCC患者癌組織和癌旁下咽粘膜組織中TNFR1及TNFR2的表達(dá)。 結(jié)果： 1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 1.1TNFR在HPSCC組織及癌旁組織中的表達(dá)：45例HPSCC癌組織中，TNFR1和TNFR2的陽(yáng)性表達(dá)率均為100%。TNFR1在癌旁粘膜組織中的表達(dá)率為50%，TNFR2在癌旁下咽粘膜組織中的表達(dá)率為10%。與癌旁下咽粘膜組織比較，TNFR1與TNFR2在HPSCC癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高（P＜0.01），表達(dá)水平也顯著高于癌旁下咽粘膜組織（P＜0.01） 1.2TNFR與HPSCC臨床病理因素的關(guān)系： 在45例HPSCC病人中，TNFR1和TNFR2的AOD在60歲以下組和60歲以上組的差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異（TNFR1：t=0.125，P=0.901；TNFR2：t=0.149，P=0.883）。在37例男性病人和8例女性病人中，TNFR1和TNFR2的表達(dá)與性別無(wú)差異（TNFR1：t=0.060，P=0.952;TNFR2：t=0.959，P=0.343）。45例HPSCC中，30例為梨狀窩型，10例環(huán)后區(qū)型，5例為下咽后壁區(qū)，TNFR1和TNFR2的表達(dá)在三種分型中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（TNFR1：F=0.169，P=0.845；TNFR2：F=1.888，P=0.164）。 TNFR1在13例高分化鱗癌中的AOD為0.192±0.051，在32例低分化鱗癌中的表達(dá)為0.239±0.029，兩者之間有顯著差異（t=3.822，P＜0.01）；TNFR1在T3-T4表達(dá)的AOD為0.239±0.030，明顯高于其在T1-T2期的表達(dá)（AOD為0.178±0.044）兩者之間有顯著性差異（t=5.087，P＜0.01）；TNFR1在臨床分期Ⅲ-Ⅳ級(jí)的AOD為0.241±0.029，表達(dá)高于II期的AOD為0.187±0.045，兩者之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=4.751，P＜0.01）；TNFR1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中的表達(dá)0.241±0.030明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組0.194±0.046，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.189，P＜0.01）。TNFR1在HPSCC癌組織中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、腫瘤的T分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與性別、年齡、分型無(wú)關(guān)（P＞0.05）。 TNFR2在高分化鱗癌13例中AOD為0.226±0.055，在32例低分化鱗癌中的表達(dá)為0.205±0.040，在10例T1-2分期組織中表達(dá)的AOD為0.227±0.061，在T3-4期AOD為0.206±0.040，在臨床分期為Ⅱ期的AOD為0.221±0.057，Ⅲ-Ⅳ0.207±0.040，在30例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)的AOD為0.202±0.036，在15例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AOD為0.229±0.056。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TNFR2的表達(dá)與HPSCC患者的年齡、性別、腫瘤的生長(zhǎng)部位、分化等級(jí)、臨床分期、T分期均無(wú)相關(guān)性（P均＞0.05）。 2TNFR1與TNFR2的相關(guān)性分析 TNFR1和TNFR2的表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.305），TNFR1與TNFR2的AOD比值與HPSCC的分化程度、T分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與性別、年齡、分型無(wú)關(guān)（P均＞0.05）。TNFR1與TNFR2在HPSCC的發(fā)生、發(fā)展中存在一定的相互調(diào)節(jié)作用，其確切機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。 3Western blot結(jié)果： TNFR1在3例HPSCC癌組織中的表達(dá)為0.822±0.144，在3例癌旁下咽粘膜組織表達(dá)為0.080±0.104，TNFR1在癌組織中的表達(dá)明顯高于在癌旁下咽粘膜組織的表達(dá)，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=5.079，P＜0.05）。TNFR2在3例HPSCC癌組織中的表達(dá)為0.775±0.072，在3例癌旁粘膜組織中的表達(dá)為0.010±0.005，TNFR2在HPSCC癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁粘膜組織中的表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間有顯著差異（t=17.333，P＜0.01）。 結(jié)論：TNFR1和TNFR2在HPSCC癌組織中的表達(dá)較癌旁下咽粘膜組織均明顯升高。TNFR1的表達(dá)水平與腫瘤的病理分化程度、腫瘤T分期、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；TNFR2的表達(dá)與腫瘤的臨床病理因素?zé)o顯著關(guān)系；TNFR1與TNFR2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者的比值與HPSCC的臨床病理因素呈正相關(guān)，說(shuō)明TNFR1和TNFR2之間存在著一定的負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系。TNFR在HPSCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 第二部分慢病毒介導(dǎo)的利用基因開(kāi)關(guān)穩(wěn)定高表達(dá)人TNFR2基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系的建立 目的：構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的利用基因開(kāi)關(guān)系統(tǒng)穩(wěn)定高表達(dá)人TNFR2基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系，為后續(xù)研究調(diào)控TNFR表達(dá)對(duì)TNF、DDP作用的影響提供細(xì)胞模型。 方法： 1Tet-on-Puro-TNFR2慢病毒載體的構(gòu)建 TNFR2基因序列調(diào)取引物由上海桑尼生物合成，TNFR2原始ORF（open reading frame, ORF）購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司，PCR擴(kuò)增TNFR2ORF序列，并將PCR產(chǎn)物與Tet-on系列慢病毒載體pHBTet-on-Puro同步XhoI和EcoRI雙酶切，回收。將酶切的PCR產(chǎn)物與載體連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的TNFR2平板挑菌，菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。 2構(gòu)建質(zhì)粒的包裝前準(zhǔn)備 2.1慢病毒系統(tǒng)構(gòu)成：三質(zhì)粒Tet-on慢病毒系統(tǒng)包括慢病毒質(zhì)粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（對(duì)照為pHBTet-on-Puro空質(zhì)粒,該Tet-on慢病毒系統(tǒng)購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司），包裝輔助質(zhì)粒：pspax2、pMD2G，其中pHBTet-on-Puro-TNFR2具有Puromycin藥物抗性，可以進(jìn)行藥物篩選；同時(shí)帶有藥物誘導(dǎo)下啟動(dòng)子UBC，可以通過(guò)強(qiáng)力霉素（Doxorubicin，Dox）誘導(dǎo)目的基因TNFR2的表達(dá)。 2.2慢病毒載體高純度制備：將制備的慢病毒質(zhì)粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（對(duì)照為pHBTet-on-Puro空質(zhì)粒）及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒pspax2、pMD2G，分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，制備出高純度的慢病毒質(zhì)粒及包裝輔助質(zhì)粒。 3慢病毒包裝 用LipoFiterTM脂質(zhì)體介導(dǎo)慢病毒載體pHBTet-on-Puro-TNFR2（對(duì)照為pHBTet-on-Puro空質(zhì)粒）與pspax2，pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。72小時(shí)后收取病毒上清并進(jìn)行超速離心濃縮，用500ulDMEM重懸慢病毒顆粒。 4穩(wěn)定可調(diào)控表達(dá)TNFR2基因FaDu細(xì)胞系的構(gòu)建 將濃縮的慢病毒顆粒感染人下咽癌FaDu細(xì)胞，嘌呤霉素篩選一周，得到穩(wěn)定可調(diào)控表達(dá)TNFR2基因的下咽癌FaDu細(xì)胞。進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞并進(jìn)行傳代，保種，擴(kuò)增及下一步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 5Tet-on調(diào)控TNFR2基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞系的驗(yàn)證 擴(kuò)增后一部分細(xì)胞用于保種，一部分細(xì)胞加入2ug/ml的Doxorudicin誘導(dǎo)24小時(shí)之后，收集細(xì)胞蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后FaDu細(xì)胞中TNFR2的mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。 2用最優(yōu)篩選濃度為2.0μg/ml的嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)Tet-on系統(tǒng)的FaDu細(xì)胞克隆。 3經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu細(xì)胞與對(duì)照組在加入Dox誘導(dǎo)24小時(shí)后比較，TNFR2的mRNA水平明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 4Western blot法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu細(xì)胞與對(duì)照組在加入Dox誘導(dǎo)24小時(shí)后比較，TNFR2的蛋白水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論：利用慢病毒載體成功構(gòu)建利用Tet-on系統(tǒng)穩(wěn)定高表達(dá)人TNFR2基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系，為后續(xù)研究該基因的功能提供細(xì)胞模型。 第三部分利用基因開(kāi)關(guān)調(diào)控TNFR表達(dá)對(duì)下咽癌化療、TNF治療的增敏作用 目的：觀察在TNFR1和TNFR2正常表達(dá)的Fadu細(xì)胞，TNF和DDP對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響；在TNFR1正常作用，TNFR2高表達(dá)的Fadu細(xì)胞，TNF和順鉑對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響變化；以及在TNFR1作用被阻斷后，TNF和DDP對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響變化；最后觀察阻斷TNFR1作用聯(lián)合TNFR2高表達(dá)情況下，TNF和DDP對(duì)Fadu細(xì)胞增殖、凋亡的影響變化，分析TNFR1和TNFR2表達(dá)的變化對(duì)TNF和DDP作用敏感性的影響。 方法： 本部分主要研究人為調(diào)控TNFR1和TNFR2表達(dá)變化時(shí)，TNF、DDP以及二者聯(lián)合作用情況下，F(xiàn)adu細(xì)胞增殖、凋亡情況的變化。利用MTT法檢測(cè)Fadu細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 1研究TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對(duì)TNFR正常作用的Fadu細(xì)胞增殖、凋亡的影響。 2研究利用中和抗體阻斷TNFR1作用后，TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Fadu細(xì)胞增殖、凋亡情況的影響變化。 3研究在TNFR1正常作用，TNFR2高表達(dá)后，TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Fadu細(xì)胞系增殖、凋亡情況的影響變化。 4研究高表達(dá)TNFR2聯(lián)合阻斷TNFR1作用后，TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Fadu細(xì)胞系增殖、凋亡情況的影響變化。 結(jié)果： 1MTT檢測(cè)結(jié)果 1.1穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro的Fadu細(xì)胞系（A組），TNF在低濃度（0.1，1，10ng/ml）時(shí)對(duì)Fadu細(xì)胞有促增殖作用，而高濃度（50-100ng/ml）具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。Fadu細(xì)胞系對(duì)DDP作用抵抗，6μg/ml的DDP作用24h后，腫瘤細(xì)胞存活率為81.8%。TNF在低濃度與DDP聯(lián)合應(yīng)用即可明顯增強(qiáng)DDP的抗腫瘤效果。 1.2穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro的Fadu細(xì)胞系，利用中和抗體阻斷TNFR1作用后（B組），可逆轉(zhuǎn)小劑量TNF（0.1-10ng/ml）的促增殖作用（t=4.390，t=5.886，t=5.258，P均＜0.05），并且低濃度與DDP聯(lián)合作用對(duì)腫瘤的抑制作用較A組增強(qiáng)，高劑量（50-100ng/ml）TNF單獨(dú)或聯(lián)合DDP應(yīng)用，均與A組無(wú)顯著差異（P均＞0.05）。 1.3穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro-TNFR2的Fadu細(xì)胞系，Dox誘導(dǎo)TNFR2高表達(dá)（C組）后與A組相比，小劑量（0.1，1，10ng/ml）即對(duì)細(xì)胞具有增殖抑制作用，具有顯著差異（P均＜0.01），高濃度（50-100ng/ml）的TNF作用無(wú)差異（P均＞0.05）。Dox誘導(dǎo)后，可提高各濃度TNF與DDP聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效果，與A組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05）。 1.4穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-Puro-TNFR2的Fadu細(xì)胞系，同時(shí)高表達(dá)TNFR2和中和TNFR1作用（D組），與A組相比，TNF各濃度對(duì)Fadu細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用（P均＜0.05）；與B、C組相比，除TNF濃度為0.1ng/ml無(wú)差異，其他濃度均有更明顯的增殖抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；TNF和DDP聯(lián)合作用于D組細(xì)胞后，與A、B組相比，各濃度對(duì)Fadu細(xì)胞的增殖抑制作用均明顯加強(qiáng)（P均＜0.05）；與C組相比，在TNF低濃度（0.1，1，10ng/ml）時(shí)聯(lián)合DDP具有明顯抑制作用，高濃度（50-100ng/ml）無(wú)顯著差異。 2流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)TNF、TNF聯(lián)合DDP對(duì)各實(shí)驗(yàn)組FaDu細(xì)胞凋亡率的影響 2.1在10ng/ml的TNF作用下，B組與A組的凋亡率無(wú)顯著差異（t=0.918，P=0.456），C組比A組凋亡率明顯增高（t=13.504，P＜0.01）。D組與A、B組相比凋亡率明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=12.424，t=10.058，P＜0.05）；與C組相比，凋亡率無(wú)明顯變化（t=0.624，P＞0.05） 2.210ng/ml的TNF和6μg/ml的DDP共同作用后，B組與A組凋亡率無(wú)顯著差異；C組比A組凋亡率明顯增高（t=8.498，P＜0.05）；D組與A組、B組相比，凋亡率明顯升高（t=4.606，t=4.737，P＜0.05）；與C組相比，凋亡率無(wú)明顯變化（t=0.795，P＞0.05） 結(jié)論： 1在TNFR正常表達(dá)的下咽癌Fadu細(xì)胞系， TNF在低濃度（0.1-10ng/ml）時(shí)對(duì)Fadu細(xì)胞有促增殖作用，而高濃度（50-100ng/ml）具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。TNF在低濃度與DDP聯(lián)合應(yīng)用即可明顯增強(qiáng)DDP的抗腫瘤效果。 2在下咽癌Fadu細(xì)胞系中和TNFR1作用后，可逆轉(zhuǎn)低濃度TNF的促腫瘤增殖作用，并且可增強(qiáng)低濃度TNF與DDP聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效果。 3在下咽癌Fadu細(xì)胞系中，TNFR2的表達(dá)增高可增強(qiáng)低濃度TNF和各濃度TNF聯(lián)合DDP對(duì)腫瘤的增殖抑制作用，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。 4在下咽癌Fadu細(xì)胞系中，同時(shí)中和TNFR1作用和高表達(dá)TNFR2，可顯著促進(jìn)TNF和DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。 5TNFR1在下咽癌中很可能介導(dǎo)增殖通路，TNFR2可能介導(dǎo)凋亡通路，兩者的作用途徑有待我們進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)調(diào)控TNFR1和TNFR2的表達(dá)有望明顯提高下咽癌的TNF和DDP的治療效果，克服治療抵抗。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2575281