【摘要】：鼻咽癌是起源于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域分布特征，在東南亞地區(qū)和中國南方有極高的發(fā)病率，年發(fā)病率為20~30/10萬。根據(jù)國際癌癥研究署的全球惡性腫瘤的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2008年新發(fā)鼻咽癌病人超過84,000人，其中80%在亞洲，5%在歐洲。病因?qū)W研究顯示鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染、種族背景、飲食習(xí)慣、喝酒和環(huán)境因素相關(guān)。現(xiàn)在，隨著影像診斷、放療技術(shù)的進步和聯(lián)合放化療的應(yīng)用，使鼻咽癌局部病灶得到更好的控制。然而，多數(shù)鼻咽癌患者在初次診斷時已為晚期，其治療效果還不盡如人意，III期和IV期患者的5年生存率分別為53%~80%、28%~61%。因此，努力更好地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的特異性治療靶點，在鼻咽癌早期診斷、個體化治療治療、預(yù)后中顯得尤為重要。 Calpain是Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白水解酶家族。至今，在人類已鑒定14個家族成員，大部分成員與細胞粘附相關(guān)，參與細胞的伸展、遷移、增殖、細胞周期的的調(diào)控和凋亡等。Capn4（又稱為Capn4S1）是calpain蛋白的一個小分子調(diào)節(jié)亞基，在調(diào)節(jié)calpain的穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。多項研究表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障礙。在轉(zhuǎn)基因小鼠中的研究顯示敲除Capn4基因可顯著降低calpain活性，從而影響小鼠的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚胎早期死亡；Knockdown Capn4降低成纖維細胞的遷移和粘附能力。最近的研究報道Capn4在肝細胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細胞癌中高表達，而且Capn4表達程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。干擾Capn4的表達能夠顯著降低肝細胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細胞癌的細胞侵襲和遷移能力。由此，推測Capn4在轉(zhuǎn)移癌的細胞遷移和粘附中發(fā)揮一定的作用，其在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮類似的作用尚不清楚。 【目的】 1、研究Capn4在鼻咽癌中的表達情況，及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；2、探討Capn4在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在的分子機制。 【方法】 1、分別應(yīng)用RT-PCR和Western-blot方法檢測Capn4在新鮮活檢鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞系中的mRNA和蛋白表達水平；2、免疫組化分析Capn4在鼻咽癌組織中的表達及統(tǒng)計學(xué)分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；3、構(gòu)建Capn4siRNA，應(yīng)用transwell實驗和裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移實驗分析Capn4對鼻咽癌細胞系5-8F、CNE2體內(nèi)外侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響；4、Western blot分析Capn4對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的影響；6、分別應(yīng)用RT-PCR和明膠酶譜法分析MMP2的mRNA表達情況和酶活性；7、上調(diào)、下調(diào)MMP2的表達，transwell實驗觀察MMP2對Capn4調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；8、Western blot分析NF-κB p65的磷酸化情況；9、細胞增殖實驗、平板克隆實驗、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗分析Capn4對鼻咽癌細胞在體內(nèi)外增殖能力的影響；10、流式細胞儀分析Capn4對鼻咽癌細胞周期的影響；11、Western blot分析Capn4對細胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的影響。 【結(jié)果】 1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達顯著高于正常鼻咽組織 無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，新鮮細針穿刺活檢鼻咽癌組織（7例）中的Capn4表達要明顯高于正常鼻咽組織（2例）。同樣，Capn4在鼻咽癌細胞系5-8F,、CNE2、6-10B的表達明顯高于永生化的正常鼻咽上皮細胞系NP69。我們進一步擴大樣本量收集了183例的石蠟組織，其中153例鼻咽癌組織，30例非癌鼻咽組織，應(yīng)用免疫組化進行檢測分析。結(jié)果顯示Capn4在鼻咽癌組織中的表達高于非癌鼻咽組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.001)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示Capn4的表達強度與EB病毒感染、鼻咽癌組織的浸潤深度、分化程度、TNM分期及是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。即EB病毒感染者Capn4陽性表達率高于無EB病毒感染；腫瘤分化程度越高，Capn4的陽性表達率越低；腫瘤分期越晚，Capn4的陽性表達率越高；出現(xiàn)遠處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達率要明顯高于未轉(zhuǎn)移的，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Kaplan Meier生存期分析顯示Capn4在鼻咽癌中表達的程度與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，Capn4高表達的患者總生存期、無進展生存期均低于低表達者(P=0.002, P=0.003)。 2、下調(diào)Capn4的表達能夠在體內(nèi)外降低鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力 我們成功構(gòu)建了兩對Capn4小干擾RNA (Capn4/siRNA-1andCapn4/siRNA-2)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染5-8F、CNE2鼻咽癌細胞系。RT-PCR和Western blot分析顯示與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA-1、 Capn4/siRNA-2的細胞內(nèi)Capn4mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。Transwell和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗在體內(nèi)外證實轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力顯著低于對照細胞，結(jié)果顯示：對照組出現(xiàn)7/10例肝肺轉(zhuǎn)移，而注射轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA細胞的裸鼠只出現(xiàn)1/10的肝轉(zhuǎn)移和2/10例的肺轉(zhuǎn)移。 3、Capn4通過上調(diào)MMP2的表達促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移 為深入研究Capn4調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的分子機制，Western blot結(jié)果表明siRNA下調(diào)Capn4的表達能夠引起MMP2、Snail和Vimentin的低表達，E-cadherin的高表達，但對MMP9、N-cadherin和β-catenin的表達沒有影響。RT-PCR進一步證實轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA能引起鼻咽癌細胞內(nèi)MMP2mRNA表達的下調(diào)；明膠酶譜檢測MMP2的酶活性也顯示在5-8F、CNE2兩個細胞系內(nèi)下調(diào)Capn4的表達均能引起MMP2酶活性的降低。為了確定Capn4是否是通過誘導(dǎo)MMP2的表達來調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞的遷移和侵襲，我們首先應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)鼻咽癌細胞系MMP2的表達，然后觀察細胞的遷移和侵襲能力，實驗結(jié)果顯示：下調(diào)MMP2的表達能引起5-8F、CNE2細胞的遷移和侵襲能力下降，且其下降程度與siRNACapn4細胞相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。最后我們在抑制鼻咽癌細胞內(nèi)Capn4表達的基礎(chǔ)上，過表達MMP2的表達，觀察細胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示：在5-8F、CNE2細胞系中外源性過表達MMP2后均能夠恢復(fù)siRNACapn4所引起的細胞遷移和侵襲能力的下降。 4、Capn4調(diào)節(jié)MMP2的表達是通過NF-κB的活化 有研究報道在肝細胞癌中NF-κB是Capn4促細胞轉(zhuǎn)移的下游效應(yīng)分子，，此外，在即往的多個研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠上調(diào)MMP2的表達來促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。因此，我們就設(shè)想Capn4在鼻咽癌細胞系中上調(diào)MMP2的表達是否也是通過活化NF-κB來完成的。Western blotting分析顯示siRNA下調(diào)Capn4的表達后能顯著降低細胞內(nèi)NF-κB p65的磷酸化；相反，外源性的過表達Capn4后能增加細胞內(nèi)NF-κB p65的磷酸化。最后我們應(yīng)用NF-κB抑制劑helenalin抑制NF-κB的活性，觀察細胞內(nèi)MMP2的表達變化，結(jié)果顯示不管是過表達Capn4還是knockdownCapn4，細胞在應(yīng)用helenalin抑制劑后，細胞內(nèi)MMP2的表達水平與對照細胞相比，均有明顯的下降，該結(jié)果表明抑制NF-κB的活性能夠抑制Capn4對MMP2表達的誘導(dǎo)。 5、體內(nèi)外實驗證實Capn4促進鼻咽癌細胞的增殖 Western blot分析顯示與親本細胞及對照細胞相比，5-8F/siRNA、CNE2/siRNA細胞內(nèi)的細胞增殖標(biāo)志PCNA蛋白的表達明顯降低。緊接著，我們應(yīng)用CCK8實驗進一步觀察Capn4對鼻咽癌細胞體外增殖能力的影響，下調(diào)Capn4的表達可使鼻咽癌細胞5-8F、CNE2生長能力下降，與親本細胞相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。平板克隆實驗結(jié)果同樣顯示：與轉(zhuǎn)染空載體的對照細胞系相比，轉(zhuǎn)染小干擾RNA的5-8F、CNE2細胞其克隆形成數(shù)明顯下降(P 0.05)。我們進一步觀察下調(diào)Capn4的表達對鼻咽癌細胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響，與注射轉(zhuǎn)染空載體5-8F/Control細胞相比，注射5-8F/siRNA1細胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤增長相對緩慢，腫瘤體積明顯小于對照組（P＜0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。提取裸鼠體內(nèi)移植瘤的蛋白組織行Western-blot分析，結(jié)果顯示：第六周時，轉(zhuǎn)染小干擾RNA在體內(nèi)仍可有效地抑制細胞內(nèi)Capn4的表達。 6、抑制Capn4的表達能夠阻滯鼻咽癌細胞周期進展 為進一步探討Capn4促進鼻咽癌細胞增殖的分子機制，我們應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞DNA的含量，結(jié)果顯示：與對照5-8F/Control細胞（51.2±1.1%）相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA1和Capn4/siRNA2的鼻咽癌細胞5-8F G1期DNA含量（68.5±1.7%；60.7±1.3%）明顯增加，S期DNA含量明顯減少，P＜0.05。為了進一步觀察Capn4影響鼻咽癌細胞的增殖能力，是否是通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)調(diào)控分子的表達。我們應(yīng)用Western blot檢測了細胞周期相關(guān)分子CyclinD1、CyclinD2、CyclinE、CDK2、CDK4、P27、P57、P21的表達情況，結(jié)果顯示：下調(diào)Capn4的表達，引起CyclinD1、CyclinD2、CyclinE的表達降低和P27表達的增多，而CDK2、CDK4、P57、P21的表達沒有變化。 【結(jié)論】 1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達要顯著高于正常鼻咽組織，Capn4在鼻咽癌組織中的表達水平與EB病毒的感染、組織的分化程度、TNM分期、腫瘤的體積以及是否出現(xiàn)淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；2、用小干擾RNA下調(diào)Capn4的表達可以明顯抑制鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和成瘤能力；3、Capn4促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲，可能是依賴NF-κB信號通路上調(diào)MMP2的表達來實現(xiàn)；4、抑制Capn4的表達可以阻止鼻咽癌細胞由G1期向S期進展，使細胞停滯于G0/1期，其潛在的機制可能是部分通過下調(diào)Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin E，上調(diào)p27來實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Marlinda Adham;Antonius N.Kurniawan;Arina Ika Muhtadi;Averdi Roezin;Bambang Hermani;Soehartati Gondhowiardjo;I Bing Tan;Jaap M.Middeldorp;;Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia:epidemiology,incidence,signs,and symptoms at presentation[J];癌癥;2012年04期

2 張欣欣,郭永清,葉青,楊占泉,董震;基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9和MMP2與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1999年08期

3 王紅兵;譚喬燕;楊本艷姿;鄒小兵;楊力;;腫瘤細胞遷移模式及其轉(zhuǎn)換調(diào)控的研究進展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2011年06期

4 黃騰波,柳青,黃惠明,曹素梅;廣東鼻咽癌遺傳流行病學(xué)研究[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2002年02期

本文編號：2571202