【摘要】： 背景 熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(heat shock transcription factor 4,Hsf4)被認(rèn)為是一種新的與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)基因,在Hsf4 DNA結(jié)合域或其它調(diào)節(jié)域的錯(cuò)義突變與人先天性或家族常染色體顯性或隱性遺傳性白內(nèi)障密切相關(guān),這些基因突變與動(dòng)物先天性白內(nèi)障發(fā)生也密切相關(guān),小鼠模型中Hsf4基因缺失可妨礙晶狀體上皮細(xì)胞增殖和纖維細(xì)胞終未分化,從而導(dǎo)致出生后晶狀體核白內(nèi)障。 Hsf4有Hsf4a、Hsf4b兩種亞型,Hsf4b是調(diào)節(jié)鼠晶狀體發(fā)育中唯一亞型,已報(bào)道Hsf4b基因缺失不僅可以下調(diào)許多熱休克蛋白(例如:Hsp25γ-晶體蛋白,β-晶體蛋白和骨骼肌蛋白)的表達(dá),而且可以上調(diào)鼠晶狀體組織中許多基因的表達(dá)(例如:FGF家族成員),這些研究表明Hsf4b通過對(duì)其下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制雙重作用而調(diào)控晶狀體發(fā)育,但是,調(diào)節(jié)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的信號(hào)通路還不清楚。 目的 探討Hsf4調(diào)控晶狀體發(fā)育的分子機(jī)制。通過探究Hsf4在上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用,揭示Hsf4基因突變所致先天性白內(nèi)障的致病機(jī)理,為早期診斷和治療Hsf4突變相關(guān)的先天性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。 方法 用人心臟cDNA文庫為模板,應(yīng)用囊括Hsf4b全長的引物進(jìn)行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag標(biāo)簽。將PCR產(chǎn)物經(jīng)Kpn I和EcoR I酶切后,與該二酶線性化pcDNA3.0質(zhì)粒一起連接獲得重組質(zhì)粒pcDNA-Flag-Hsf4b,將克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,并用抗Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)Pull down實(shí)驗(yàn)證明Hsf4b可與MAP激酶P38結(jié)合,激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P38可體外磷酸化Hsf4b。 用Hsf4-/-小鼠的晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染SV40,T-抗原,G418篩選建立永生化細(xì)胞系MLEC/Hsf4-/-。應(yīng)用不同的含有CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒(如腺病毒載體),在mLEC細(xì)胞和其他細(xì)胞系中表達(dá)Hsf4b,測(cè)定Hsf4b對(duì)CMV啟動(dòng)子的抑制作用。DNA-蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)和DNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)體外測(cè)定Hsf4b與CMV啟動(dòng)子的結(jié)合。免疫印跡檢測(cè)Hsf4b/S299磷酸化抑制Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性,免疫沉淀和細(xì)胞內(nèi)GST pull down實(shí)驗(yàn)證明Hsf4蛋白可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)因子Daxx,免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hsf4b被摹集到核內(nèi)Daxx的POD核小體內(nèi)。 結(jié)果 成功構(gòu)建熱休克轉(zhuǎn)錄因子4b (Hsf4b)的真核表達(dá)載體并在真核細(xì)胞HEK293T中表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)Hsf4b可與MAP激酶P38結(jié)合,Hsf4b的C-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)參與和P38的結(jié)合, P38可體外磷酸化Hsf4b。 Hsf4b具有轉(zhuǎn)錄抑制功能,Hsf4b可與CMV啟動(dòng)子中176bp處TTC(HSE序列)的序列直接結(jié)合,抑制CMV啟動(dòng)子活性,把此序列中TTC突變?yōu)镚CC可抑制Hsf4b對(duì)CMV活性的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Hsf4b轉(zhuǎn)錄抑制功能通過與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)因子Daxx結(jié)合實(shí)現(xiàn),Hsf4b被摹集到核內(nèi)Daxx的POD核小體內(nèi),Hsf4b與Daxx的結(jié)合受Hsf4b/S299磷酸化調(diào)控。 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)首次證明Hsf4b與P38結(jié)合而被磷酸化,并且發(fā)現(xiàn)Hsf4b具有轉(zhuǎn)錄抑制功能,Hsf4b/S299磷酸化可調(diào)控Hsf4b與Daxx結(jié)合從而調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄抑制活性。為進(jìn)一步探討Hsf4b在晶狀體發(fā)育過程中的作用提供了新的信號(hào)通路。
【圖文】：

15圖1 重組質(zhì)粒pCDNA3-flag-hsf4b 的酶切鑒定Fig 1 Identification of pCDNA3-flag-hsf4b by enzyme digestion1: DNA Marker; 2: pCDNA3-flag-hsf4b; 3and4:pCDNA3-flag-hsf4b / EcoR I and Kpn11.4.2 Hsf4b 在 HEK 293T 細(xì)胞中的表達(dá)我們將克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b 轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，并用抗Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，，轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-Hsf4b 質(zhì)粒的細(xì)胞 在60KD處表達(dá)兩條Hsf4b帶（圖2,泳道2),上面條帶為磷酸化Hsf4b[12]，下面條帶為Hsf4b; 而轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞則沒出現(xiàn)新的蛋白條帶( 圖2, 泳道1) , 說明重組表達(dá)質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。

圖2 pCDNA3-flag-hsf4b 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞表達(dá)的Wes tern blot 分析Fig2 Expression of pCDNA3-flag-hsf4b detected by Western blot1.4.3 Hsf4b 結(jié)合 MAP 激酶 P38已有報(bào)道， Hsf4 受磷酸化調(diào)控，Hsf4b 可結(jié)合MAP 激酶 Erk1/體外磷酸化[12]。為進(jìn)一步探討Hsf4b 是否受其他MAP激酶家族成員的了免疫沉淀試驗(yàn)。將pcDNA3 空質(zhì)粒和pcDNA-Flag-Hsf4b 分別轉(zhuǎn)入H中，用抗Flag 抗體作免疫沉淀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsf4b 可與細(xì)胞內(nèi)源的p3起免疫共沉淀（圖3，泳道 2 ）。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒則不能沉淀P38蛋白（圖3上部第三泳道為細(xì)胞裂解液中內(nèi)源P38 的表達(dá)， 用于陽性對(duì)照。疫沉淀的Hsf4b 蛋白。結(jié)果說明Flag-Hsf4b和P38可以結(jié)合。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R776.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 林燕瑜;李青;楊佩菲;;熱休克轉(zhuǎn)錄因子4與先天性白內(nèi)障[J];福建醫(yī)藥雜志;2007年04期

2 裴雪婷;鮑永珍;;先天性白內(nèi)障的基因診斷[J];眼科研究;2007年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 柯鐵;眼科遺傳疾病的分子遺傳學(xué)分析[D];華中科技大學(xué);2006年

2 張?zhí)鞎?兩種遺傳性眼病致病基因的定位與突變研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

3 繆愛珠;HSF4對(duì)HLECs蛋白表達(dá)的影響及與老年性白內(nèi)障的相關(guān)性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 黃二文;一先天性白內(nèi)障家系的分子遺傳學(xué)分析[D];華中科技大學(xué);2009年

2 甘冠騎;應(yīng)用GSTpull-down篩查HSF4b相互作用蛋白[D];華中科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2563146