發(fā)布時間：2019-11-19 05:36

【摘要】：目的:1.通過原代培養(yǎng)人喉癌實(shí)體瘤細(xì)胞,克隆分離異質(zhì)性細(xì)胞亞群,篩選出腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群。 2.比較喉癌腫瘤干細(xì)胞樣亞群與不同細(xì)胞亞群細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的差異,初步篩選人喉癌實(shí)體瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物。 方法:1.原代培養(yǎng)人喉癌實(shí)體瘤細(xì)胞,組織標(biāo)本取材于山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科15例診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的新鮮實(shí)體瘤手術(shù)標(biāo)本。 2.應(yīng)用有限稀釋法對體外培養(yǎng)的喉癌細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng),分離異質(zhì)性亞群,選取其中形態(tài)差別最大的兩個克隆集落命名為1型和2型細(xì)胞亞群,分別進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。I型和2型亞群細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行單細(xì)胞亞克隆培養(yǎng)。比較其在形態(tài)及分化能力方面的差異。 3.MTT(甲基噻唑基四唑)法檢測1型和2型亞群細(xì)胞的增殖活性;流式細(xì)胞儀檢測兩亞群細(xì)胞增殖周期;兩型細(xì)胞分別裸鼠移植檢測其成瘤能力。 4.應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)定性的觀察1型和2型亞群細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況;流式細(xì)胞技術(shù)定量的檢測兩型亞群細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133、CD44的表達(dá)。5.所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,SPS統(tǒng)計軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn),以P0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果:1.喉癌實(shí)體瘤細(xì)胞分離得到1型和2型細(xì)胞形態(tài)差異最大的兩個亞群。1型細(xì)胞成長梭形,突起少,亞克隆培養(yǎng)未產(chǎn)生子代細(xì)胞;2型細(xì)胞成多角形,多突起,繼續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的子代克隆出現(xiàn)異質(zhì)性細(xì)胞。 2.MTT法檢測兩型細(xì)胞的增值能力,2型亞群細(xì)胞在接種5天后顯示出比1型細(xì)胞更強(qiáng)的增值活性。 3.流式細(xì)胞儀測定DNA相對含量,確定細(xì)胞各時相所占的百分率。大部分2型細(xì)胞處在G0/G1期,顯著高于1型細(xì)胞,經(jīng)t檢驗(yàn)由顯著差異(P0.05)。 4.1型腫瘤細(xì)胞種植6周后裸鼠皮下未見瘤體形成(0/5);2型腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下種植2周后形成瘤體,成瘤率為100%(5/5)。2型亞群細(xì)胞亞克隆的子代多角形細(xì)胞種植到裸鼠皮下,成瘤率也達(dá)100%(5/5);而1型子代梭形細(xì)胞種植到裸鼠皮下未見成瘤。體外增值能力強(qiáng),處于細(xì)胞周期G0/G1的比例明顯高于1型細(xì)胞,是具有腫瘤干細(xì)胞特性的亞群。 5.經(jīng)細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示1型亞群細(xì)胞中CD44-FITC、CD133-FITC染色均為陰性;2型亞群細(xì)胞CD44-FITC染色強(qiáng)陽性,布滿爬片,CD133-FITC染色恒量陽性,與2型細(xì)胞一定量的結(jié)合,均表達(dá)為細(xì)胞周緣綠色強(qiáng)熒光。 6.流式細(xì)胞技術(shù)示CD44、CD133在1型亞群細(xì)胞不表達(dá);2型亞群細(xì)胞中,95.1%±2.3%的細(xì)胞表達(dá)膜抗原CD44,23.8%±1.7%的細(xì)胞表達(dá)膜抗原CD133。與細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)的結(jié)果吻合。 結(jié)論:1.原發(fā)性人喉癌實(shí)體瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性,存在著腫瘤干細(xì)胞樣亞群。在本實(shí)驗(yàn)中,2型亞群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性。 2.膜抗原CD133、CD44可作為喉癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記物。
【圖文】：

1 喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征喉癌細(xì)胞剛接種入培養(yǎng)瓶時倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞有明顯的腫瘤細(xì)胞特征，大部分細(xì)胞體積大呈圓形，胞質(zhì)豐滿透明，細(xì)胞核大或雙核（圖1a）；經(jīng)含5％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)并反復(fù)純化后呈現(xiàn)為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞貼壁生長,略呈梭形,細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時呈“鋪路石”狀（圖1b）。角蛋白細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果為：部分腫瘤細(xì)胞核被染成棕黃色，大部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，說明經(jīng)原代培養(yǎng)的絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為角蛋白陽性，符合上皮細(xì)胞來源（圖1c），排除成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為喉癌上皮細(xì)胞。圖 1 原代培養(yǎng)喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 1a 剛接種時細(xì)胞體積大呈圓形，胞質(zhì)豐滿透明 ×400；1b 細(xì)胞貼壁生長,略呈長梭形,長滿時呈“鋪路石”狀 ×400； 1c 喉癌細(xì)胞中角蛋白的細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果SP 法檢測 角蛋白在喉癌細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，胞質(zhì)和胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒 DAB 顯色 ×4002 1型和2型亞群細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)常規(guī)培養(yǎng) 72 小時，，相差顯微鏡下觀察，1 型細(xì)胞長梭形，突起較少（圖 2A）；2 型細(xì)胞多角形

1 原代培養(yǎng)喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 1a 剛接種時細(xì)胞體積大呈圓形，胞質(zhì)豐滿透明 ×400；1b貼壁生長,略呈長梭形,長滿時呈“鋪路石”狀 ×400； 1c 喉癌細(xì)胞中角蛋白的細(xì)胞化學(xué)染色SP 法檢測 角蛋白在喉癌細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，胞質(zhì)和胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒 DAB 顯色 ×4001型和2型亞群細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)常規(guī)培養(yǎng) 72 小時，相差顯微鏡下觀察，1 型細(xì)胞長梭形，突起較少（圖 2A）；2 型角形，聚集生長，體積較均勻，突起多（圖 2B）。1 型細(xì)胞亞克隆培養(yǎng)未能產(chǎn)生子代，2 型細(xì)胞亞克隆培養(yǎng)，產(chǎn)生的子代克隆出現(xiàn)了長梭形和多角形兩型細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 李茗初;鄧永文;伍軍;陳風(fēng)華;劉勁芳;方加勝;;髓母細(xì)胞瘤中腦腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];癌癥;2006年02期

2 黃強(qiáng);董軍;朱玉德;張全斌;季曉燕;王愛東;蘭青;;人腦膠質(zhì)瘤組織中分離與培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞[J];中華腫瘤雜志;2006年05期

本文編號：2562947