本文關(guān)鍵詞：FoxO1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β誘導(dǎo)的自刺激中的作用及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并發(fā)癥,也被認(rèn)為是一種慢性低度炎癥性疾病。在糖尿病的早期階段,DR的特征是視網(wǎng)膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破壞,而組成內(nèi)層視網(wǎng)膜屏障的主要部分是內(nèi)皮細(xì)胞,并且隨著糖尿病病程的延長,內(nèi)皮細(xì)胞死亡數(shù)目增加。除內(nèi)皮細(xì)胞死亡外,炎癥介質(zhì)也會通過激活細(xì)胞內(nèi)信號增加血管通透性。炎癥因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和動物模型的視網(wǎng)膜、玻璃體和血清中升高,還能以旁分泌和自分泌的方式誘導(dǎo)自身的合成,加速并擴(kuò)大糖尿病視網(wǎng)膜中的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族中重要的一員,在調(diào)控增殖凋亡、氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)自噬和分化等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在1型和2型糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜中,Fox O1的活性增加,并伴隨著炎癥反應(yīng)和凋亡增加。因此推測DR狀態(tài)下Fox O1活性增加可能與炎癥有一定的聯(lián)系,但Fox O1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),在原代大鼠肝細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中,IL-1β通過刺激IL-1受體過表達(dá)導(dǎo)致胞質(zhì)和核內(nèi)Fox O1蛋白量增加。而在巨噬細(xì)胞中,Fox O1直接結(jié)合到IL-1β啟動子上,促進(jìn)IL-1β的表達(dá)增加。因此推測,IL-1β在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中可刺激Fox O1表達(dá)增加,從而促進(jìn)IL-1β的表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)以Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的Fox O1的表達(dá)及活性,觀察Fox O1在IL-1β誘導(dǎo)的自刺激中的作用,并探討其機(jī)制。方法原代人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMECs)培養(yǎng)于不同糖濃度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting法檢測Fox O1、IL-1β的表達(dá)。HRMECs培養(yǎng)于重組人白介素-1β(r IL-1β)的不同濃度(0、1、2.5、10、25、100ng/m L)24h后,Real-time PCR、Western blotting檢測處理后細(xì)胞的Fox O1、IL-1β、Caspase-8表達(dá),細(xì)胞免疫熒光檢測處理后細(xì)胞中Fox O1的表達(dá)分布,流式細(xì)胞儀檢測不同濃度r IL-1β處理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培養(yǎng)于IL-1受體阻斷劑(IL-1RA)、MAPK阻斷劑(U0126、SB203580、SP600125)中伴或不伴r IL-1β(10ng/m L),Western blotting法檢測Fox O1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表達(dá)。將構(gòu)建的Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體及空慢病毒載體(LV-NC)轉(zhuǎn)染于正常培養(yǎng)的HRMECs,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)過r IL-1β(10ng/m L)刺激24h后,Real-time PCR、Western blotting法檢測Fox O1、IL-1β的表達(dá)。40只SPF級雄性SD大鼠,隨機(jī)選取其中30只構(gòu)建糖尿病大鼠模型,10只作為正常對照組(NC組)。糖尿病造模成功后,將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組:糖尿病組(DM組),糖尿病Fox O1干擾轉(zhuǎn)染組(LV-si-Fox O1組)和糖尿病空病毒轉(zhuǎn)染組(LV-NC組)。大鼠麻醉后,在解剖顯微鏡下玻璃體注射Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體及空慢病毒載體(LV-NC)10μl,涂抹抗生素軟膏以保護(hù)角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末,稱體重(Body Weight,BW),尾靜脈取血測血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠,迅速剝離出眼球,置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫組化檢查,于4%預(yù)冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查。新鮮眼球,去除眼前節(jié),分離出視網(wǎng)膜,迅速于液氮中冷凍,熒光定量PCR和Western bloting檢測Fox O1、IL-1β表達(dá)。結(jié)果1.高糖誘導(dǎo)HRMECs的Fox O1和IL-1β表達(dá)增加:Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA的表達(dá)水平隨著葡萄糖濃度的增加而增加,特別是糖濃度在35mmol/L時候顯著升高(P0.05)。2.r IL-1β誘導(dǎo)HRMECs的早期凋亡是濃度依賴性,但并不依賴Caspase-8的表達(dá):正常培養(yǎng)的HRMECs早期凋亡率是0.5%,而培養(yǎng)于不同濃度(1、2.5、10、25、100ng/m L)的r IL-1β后,凋亡率分別增加為5.3%,6.6%,8.1%,8.3%,12.6%。不同濃度的r IL-1β對HRMECs的Caspase-8蛋白表達(dá)水平無明顯影響(P0.05)。3.不同濃度r IL-1β誘導(dǎo)HRMECs的Fox O1和IL-1β表達(dá)增加:與對照組相比,Fox O1和IL-1βm RNA及蛋白的表達(dá)水平隨著r IL-1β濃度的增加而明顯增加(均P0.05);細(xì)胞免疫熒光化學(xué)提示隨著r IL-1β濃度的增加,Fox O1在細(xì)胞核內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)增加,在r IL-1β濃度為25和100ng/m L時,表達(dá)顯著增加(P0.05)。4.IL-1受體阻斷劑(IL-1RA)、MAPK阻斷劑(U0126、SB203580、SP600125)減少r IL-1β誘導(dǎo)HRMECs的Fox O1表達(dá):IL-1RA可減少r IL-1β誘導(dǎo)HRMECs的Fox O1和IL-1β表達(dá)。r IL-1β可激活細(xì)胞的磷酸化MAPK(p-ERK、p-P38、p-JNK),而IL-1RA可以阻斷r IL-1β誘導(dǎo)的MAPK的磷酸化。另外,MAPK阻斷劑也可抑制r IL-1β誘導(dǎo)的Fox O1蛋白表達(dá)。5.LV si-Fox O1慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,r IL-1β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Fox O1和IL-1β表達(dá)減弱:HRMECs為原代細(xì)胞,流式檢測轉(zhuǎn)染組和空載組的轉(zhuǎn)染效率分別是68.1%和58.5%。與正常組相比,IL-1β組和LV-NC+IL-1β組Fox O1和IL-1β表達(dá)都明顯增加(P0.001);與10ng/ml r IL-1β組相比,r IL-1β+LV si-Fox O1組Fox O1的m RNA表達(dá)水平降低,但仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而r IL-1β+LV si-Fox O1組IL-1β的m RNA水平則顯著降低(P0.001)6.在大鼠視網(wǎng)膜中,慢病毒轉(zhuǎn)染可下調(diào)Fox O1和IL-1β表達(dá):與NC組相比,DM組Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA表達(dá)水平顯著增加(P0.05),而LV-si-Fox O1組Fox O1和IL-1β表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,DM組Fox O1和IL-1β免疫染色較NC組顯著增加,LV-si-Fox O1組免疫染色則不顯著,Fox O1免疫染色主要分布外網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,IL-1β免疫染色在視網(wǎng)膜全層表達(dá)增加。電鏡結(jié)果顯示正常組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體形態(tài)正常,官腔未變形。DM組和LV-NC組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體明顯腫脹,可見空泡變性,管腔明顯狹窄。LV-si-Fox O1組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體輕度腫脹,官腔未見明顯變形。結(jié)論1.在HRMECs中IL-1β通過IL-1受體激活MAPK,并促進(jìn)Fox O1表達(dá),進(jìn)而上調(diào)IL-1β。2.在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中,下調(diào)Fox O1的表達(dá)可降低視網(wǎng)膜IL-1β的表達(dá),減輕視網(wǎng)膜炎癥。
【關(guān)鍵詞】：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1 糖尿病視網(wǎng)膜病變 原代人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞 炎癥 白介素-1β
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞14-16
• 前言16-18
• 1 材料與方法18-31
• 2 結(jié)果31-36
• 3 討論36-40
• 4 結(jié)論40-41
• 附圖41-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述 糖尿病視網(wǎng)膜病變和炎癥的關(guān)系49-65
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 個人簡歷65-66
• 致謝66-67

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