本文關鍵詞：FoxO1在糖尿病大鼠視網膜和視網膜內皮細胞IL-1β誘導的自刺激中的作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并發(fā)癥,也被認為是一種慢性低度炎癥性疾病。在糖尿病的早期階段,DR的特征是視網膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破壞,而組成內層視網膜屏障的主要部分是內皮細胞,并且隨著糖尿病病程的延長,內皮細胞死亡數目增加。除內皮細胞死亡外,炎癥介質也會通過激活細胞內信號增加血管通透性。炎癥因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和動物模型的視網膜、玻璃體和血清中升高,還能以旁分泌和自分泌的方式誘導自身的合成,加速并擴大糖尿病視網膜中的炎癥級聯(lián)反應。叉頭狀轉錄因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)是叉頭狀轉錄因子O亞家族中重要的一員,在調控增殖凋亡、氧化應激、調節(jié)自噬和分化等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在1型和2型糖尿病大鼠模型的視網膜中,Fox O1的活性增加,并伴隨著炎癥反應和凋亡增加。因此推測DR狀態(tài)下Fox O1活性增加可能與炎癥有一定的聯(lián)系,但Fox O1調節(jié)內皮細胞功能的具體機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),在原代大鼠肝細胞和HEK293細胞中,IL-1β通過刺激IL-1受體過表達導致胞質和核內Fox O1蛋白量增加。而在巨噬細胞中,Fox O1直接結合到IL-1β啟動子上,促進IL-1β的表達增加。因此推測,IL-1β在視網膜內皮細胞中可刺激Fox O1表達增加,從而促進IL-1β的表達增加。本實驗以Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體下調內皮細胞和STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜中的Fox O1的表達及活性,觀察Fox O1在IL-1β誘導的自刺激中的作用,并探討其機制。方法原代人視網膜血管內皮細胞(HRMECs)培養(yǎng)于不同糖濃度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting法檢測Fox O1、IL-1β的表達。HRMECs培養(yǎng)于重組人白介素-1β(r IL-1β)的不同濃度(0、1、2.5、10、25、100ng/m L)24h后,Real-time PCR、Western blotting檢測處理后細胞的Fox O1、IL-1β、Caspase-8表達,細胞免疫熒光檢測處理后細胞中Fox O1的表達分布,流式細胞儀檢測不同濃度r IL-1β處理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培養(yǎng)于IL-1受體阻斷劑(IL-1RA)、MAPK阻斷劑(U0126、SB203580、SP600125)中伴或不伴r IL-1β(10ng/m L),Western blotting法檢測Fox O1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表達。將構建的Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體及空慢病毒載體(LV-NC)轉染于正常培養(yǎng)的HRMECs,轉染后的細胞經或不經過r IL-1β(10ng/m L)刺激24h后,Real-time PCR、Western blotting法檢測Fox O1、IL-1β的表達。40只SPF級雄性SD大鼠,隨機選取其中30只構建糖尿病大鼠模型,10只作為正常對照組(NC組)。糖尿病造模成功后,將成模糖尿病大鼠隨機分為3組:糖尿病組(DM組),糖尿病Fox O1干擾轉染組(LV-si-Fox O1組)和糖尿病空病毒轉染組(LV-NC組)。大鼠麻醉后,在解剖顯微鏡下玻璃體注射Fox O1特異性小干擾RNA(si RNA)慢病毒載體及空慢病毒載體(LV-NC)10μl,涂抹抗生素軟膏以保護角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末,稱體重(Body Weight,BW),尾靜脈取血測血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠,迅速剝離出眼球,置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫組化檢查,于4%預冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查。新鮮眼球,去除眼前節(jié),分離出視網膜,迅速于液氮中冷凍,熒光定量PCR和Western bloting檢測Fox O1、IL-1β表達。結果1.高糖誘導HRMECs的Fox O1和IL-1β表達增加:Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA的表達水平隨著葡萄糖濃度的增加而增加,特別是糖濃度在35mmol/L時候顯著升高(P0.05)。2.r IL-1β誘導HRMECs的早期凋亡是濃度依賴性,但并不依賴Caspase-8的表達:正常培養(yǎng)的HRMECs早期凋亡率是0.5%,而培養(yǎng)于不同濃度(1、2.5、10、25、100ng/m L)的r IL-1β后,凋亡率分別增加為5.3%,6.6%,8.1%,8.3%,12.6%。不同濃度的r IL-1β對HRMECs的Caspase-8蛋白表達水平無明顯影響(P0.05)。3.不同濃度r IL-1β誘導HRMECs的Fox O1和IL-1β表達增加:與對照組相比,Fox O1和IL-1βm RNA及蛋白的表達水平隨著r IL-1β濃度的增加而明顯增加(均P0.05);細胞免疫熒光化學提示隨著r IL-1β濃度的增加,Fox O1在細胞核內和胞質內的表達增加,在r IL-1β濃度為25和100ng/m L時,表達顯著增加(P0.05)。4.IL-1受體阻斷劑(IL-1RA)、MAPK阻斷劑(U0126、SB203580、SP600125)減少r IL-1β誘導HRMECs的Fox O1表達:IL-1RA可減少r IL-1β誘導HRMECs的Fox O1和IL-1β表達。r IL-1β可激活細胞的磷酸化MAPK(p-ERK、p-P38、p-JNK),而IL-1RA可以阻斷r IL-1β誘導的MAPK的磷酸化。另外,MAPK阻斷劑也可抑制r IL-1β誘導的Fox O1蛋白表達。5.LV si-Fox O1慢病毒轉染細胞后,r IL-1β誘導轉染細胞的Fox O1和IL-1β表達減弱:HRMECs為原代細胞,流式檢測轉染組和空載組的轉染效率分別是68.1%和58.5%。與正常組相比,IL-1β組和LV-NC+IL-1β組Fox O1和IL-1β表達都明顯增加(P0.001);與10ng/ml r IL-1β組相比,r IL-1β+LV si-Fox O1組Fox O1的m RNA表達水平降低,但仍有統(tǒng)計學意義(P0.05),而r IL-1β+LV si-Fox O1組IL-1β的m RNA水平則顯著降低(P0.001)6.在大鼠視網膜中,慢病毒轉染可下調Fox O1和IL-1β表達:與NC組相比,DM組Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA表達水平顯著增加(P0.05),而LV-si-Fox O1組Fox O1和IL-1β表達無統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫組化結果顯示,DM組Fox O1和IL-1β免疫染色較NC組顯著增加,LV-si-Fox O1組免疫染色則不顯著,Fox O1免疫染色主要分布外網狀層、內核層、內網狀層和神經節(jié)細胞層,IL-1β免疫染色在視網膜全層表達增加。電鏡結果顯示正常組內皮細胞線粒體形態(tài)正常,官腔未變形。DM組和LV-NC組內皮細胞線粒體明顯腫脹,可見空泡變性,管腔明顯狹窄。LV-si-Fox O1組內皮細胞線粒體輕度腫脹,官腔未見明顯變形。結論1.在HRMECs中IL-1β通過IL-1受體激活MAPK,并促進Fox O1表達,進而上調IL-1β。2.在糖尿病大鼠視網膜中,下調Fox O1的表達可降低視網膜IL-1β的表達,減輕視網膜炎癥。
【關鍵詞】：叉頭狀轉錄因子O1 糖尿病視網膜病變 原代人視網膜血管內皮細胞 炎癥 白介素-1β
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞14-16
• 前言16-18
• 1 材料與方法18-31
• 2 結果31-36
• 3 討論36-40
• 4 結論40-41
• 附圖41-46
• 參考文獻46-49
• 綜述 糖尿病視網膜病變和炎癥的關系49-65
• 參考文獻57-65
• 個人簡歷65-66
• 致謝66-67

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