【摘要】：聾病嚴(yán)重影響人類健康。全世界約有2.78億患者罹患中度以上耳聾,其生活、工作和學(xué)習(xí)受到嚴(yán)重影響。如何降低聾病的發(fā)病率并使之得到及時(shí)發(fā)現(xiàn)和早期治療,己成為耳科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究者和全社會(huì)的共同責(zé)任。在聾病之中,感音神經(jīng)性耳聾的預(yù)防和治療仍然是聾病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。目前有關(guān)聽覺相關(guān)基因的功能和聾病相關(guān)致病分子機(jī)制的研究已成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一�；蚯贸蚯萌雱�(dòng)物模型的建立極大地推動(dòng)了聾病相關(guān)基因的功能研究。這些基因在毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)、離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等各個(gè)方面起到重要作用,并在時(shí)間和空間上互相協(xié)調(diào)和配合,共同調(diào)控內(nèi)耳的發(fā)育。近年來隨著細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,新的內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因及特定的表型逐漸被發(fā)現(xiàn)確定,這極大地提高了我們對(duì)聽覺分子病理機(jī)制的理解。 gfi1編碼一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,主要在神經(jīng)元和內(nèi)耳毛細(xì)胞、造血系統(tǒng)分化過程中擔(dān)當(dāng)重要角色,在不同組織中通過凋亡、增殖機(jī)制以決定細(xì)胞命運(yùn)和分化。Gfi1在小鼠中主要表達(dá)在內(nèi)耳毛細(xì)胞和神經(jīng)元中。敲除Gfi1基因的小鼠出現(xiàn)已分化但形態(tài)學(xué)有明顯異常的毛細(xì)胞,其相關(guān)神經(jīng)分布也出現(xiàn)異常。因此該基因?qū)?nèi)耳感覺毛細(xì)胞的分化和存活起到非常重要的作用。但是迄今為止Gfi1基因是否在脊椎動(dòng)物斑馬魚胚胎內(nèi)耳發(fā)育過程中發(fā)揮功能尚不清楚。因此在本研究當(dāng)中主要采用寡核苷酸Morpholino (MO)抑制gfi1基因和mRNA過表達(dá)gfi1基因的方法,以斑馬魚為模式動(dòng)物,研究gfi1在斑馬魚早期胚胎內(nèi)耳發(fā)育中的功能和機(jī)制。 斑馬魚中g(shù)fi1有兩個(gè)同源基因分別是gfi1.1和gfi1.2。其中g(shù)fi1.2在同源性上更接近于小鼠中Gfi1。對(duì)gfi1.1和gfi1.2基因的序列特性和時(shí)空表達(dá)譜研究后發(fā)現(xiàn),兩者都在受精卵時(shí)期就開始表達(dá),均為母源基因。原腸胚期時(shí)主要在外胚層神經(jīng)管中表達(dá)。19hpf后都出現(xiàn)在內(nèi)耳橢圓囊和球囊的毛細(xì)胞區(qū)域和頭部神經(jīng)組織中。不同之處在于gfi1.2在內(nèi)耳中表達(dá)時(shí)間較早,出現(xiàn)在14hpf左右聽板區(qū)感覺上皮的橢圓囊和球囊原基內(nèi),預(yù)示gfi1.2可能在早期就參予內(nèi)耳的發(fā)育。為了解兩個(gè)基因之間的關(guān)系以及在內(nèi)耳發(fā)育中的作用,我們通過分別或共同抑制gfi1.1和gfi1.2后觀察到只有和神經(jīng)元產(chǎn)生分化成熟相關(guān)的標(biāo)記基因ngn1,neurod,islet1發(fā)生了變化。但前基板到聽板形成期間以及和毛細(xì)胞分化成熟有關(guān)的標(biāo)記基因不受影響。在功能上發(fā)現(xiàn)分別或共同抑制gfi1.1和gfi1.2后能引起胚胎發(fā)育延遲,毛細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)量減少,但并不影響內(nèi)耳各結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)和形成。以上研究說明說明gfi1.1和gfi1.2的缺失能影響毛細(xì)胞和神經(jīng)元的發(fā)育。gfi1.1或gfi1.2基因也存在冗余的功能,如果其中單獨(dú)一個(gè)基因被抑制,另一個(gè)同源基因會(huì)進(jìn)行功能替代。 因gfi1.2可能在內(nèi)耳發(fā)育的早期起作用,因此本研究中進(jìn)一步探討了gfi1.2基因在內(nèi)耳感覺神經(jīng)細(xì)胞形成初期的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示在11hpf過表達(dá)gfi1.2發(fā)現(xiàn)標(biāo)記內(nèi)耳感覺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的原神經(jīng)基因ngn1和atoh16表達(dá)明顯上調(diào),而且過表達(dá)gfi1.2能夠大部分挽救注射MO對(duì)ngn1和atoh1b造成的表達(dá)變化。說明gfi1.2對(duì)原神經(jīng)基因ngn1和atoh1b的影響是特異的。為進(jìn)一步探尋gfi1.2調(diào)控ngn1機(jī)制,在觀察到gfiJ1.2是id2a的上游基因之后,過表達(dá)id2a發(fā)現(xiàn)可以使ngn1表達(dá)降低,同時(shí)過表達(dá)gfi1.2和id2a可以挽救id2a對(duì)ngn1的影響。這些結(jié)果說明gfi1.2早期可能通過抑制id2a促進(jìn)了ngn1的表達(dá)。 綜上所述,gfi1.2在斑馬魚內(nèi)耳中的作用機(jī)制可能是通過調(diào)控早期的原神經(jīng)基因,促進(jìn)早期感音神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)一步分化為不同的細(xì)胞類型,從而最終影響內(nèi)耳毛細(xì)胞和神經(jīng)元的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)首次探討了gfi1.2基因在斑馬魚內(nèi)耳當(dāng)中的作用,并為將來研究gfi1.2在感音神經(jīng)前體細(xì)胞即干細(xì)胞中的作用提供了一定的方向奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R764

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