【摘要】： 研究背景脈絡(luò)膜新生血管(CNV),為多發(fā)于黃斑部視網(wǎng)膜下的新生血管膜,易因出血、滲出及瘢痕形成而致盲。其形成包含血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)兩個(gè)形式。CNV是多種致盲性眼后節(jié)疾病的共同病理基礎(chǔ),尤其是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD),是目前西方國家中老年人群致盲的首要原因,且AMD患者中90%是因CNV致盲的。我國新生血管性AMD的發(fā)病率高于國際平均水平,而隨著中國老齡化程度的加重,這一問題也將成為我國的一大社會(huì)問題。如何防治CNV是當(dāng)前眼科學(xué)研究的重要課題。目前對于CNV和AMD的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理還不清楚。最近的研究提示AMD很可能是一種眼內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的疾病。以往研究顯示巨噬細(xì)胞(Mφ)普遍存在于CNV中,可能發(fā)揮著重要的作用,但是具體是如何作用的尚不清楚�？紤]到Mφ可能是免疫炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),研究Mφ在CNV發(fā)生發(fā)展中的作用和作用機(jī)制將有助于我們更好的理解CNV的發(fā)病機(jī)理,并可能為尋找新的治療辦法提供契機(jī)。 目的探討單核巨噬細(xì)胞(MC/Mφ)在實(shí)驗(yàn)性CNV中對血管發(fā)生的作用和作用機(jī)制 方法清除MC/Mφ有效性檢測:采用C57BL/6J小鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的氯屈膦酸鹽(clodronate-lip)清除MC/Mφ,脾臟組織免疫組化檢測Mφ數(shù)量(F4/80標(biāo)識);藥物毒性檢測:制作DiO標(biāo)記的脂質(zhì)體,尾靜脈注射小鼠體內(nèi)后,免疫熒光染色檢測視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和Mφ與脂質(zhì)體的位置關(guān)系。體外脂質(zhì)體與RPE細(xì)胞和猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮(RF/6A)細(xì)胞共培養(yǎng),MTT法檢測細(xì)胞增殖活性改變,ELISA檢測培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子α(SDF-1α)水平;清除MC/Mφ對CNV的影響:將年輕(6~8周)綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞移植給經(jīng)Co60照射的成年野生型C57BL/6J小鼠(6~8wk)建立嵌合體小鼠,532nm激光光凝誘發(fā)嵌合體小鼠CNV。實(shí)驗(yàn)組小鼠靜脈注射clodronate-lip清除全身MC/Mφ,同時(shí)設(shè)注射空脂質(zhì)體(PBS-lip)小鼠為空載體對照組以及注射PBS小鼠為正常對照組。脈絡(luò)膜鋪片觀察激光后3d和2w時(shí)激光斑處表達(dá)GFP的細(xì)胞量和CNV面積,組織切片免疫熒光染色觀察激光后3d激光斑局部血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)量以及2wk時(shí)CNVQgGFP細(xì)胞分化為EC(CD31標(biāo)識)和平滑肌細(xì)胞(SMC,α-SMA標(biāo)識)的細(xì)胞量;另觀察移植老年( 18月)GFP骨髓的年輕C57小鼠清除MC/Mφ后3d和2wk時(shí)GFP細(xì)胞量和CNV面積改變。原代分離人單核細(xì)胞(MC),接觸共培養(yǎng)或采用Millicell小室非接觸共培養(yǎng)人RPE細(xì)胞和MC,PCR和ELISA檢測RPE細(xì)胞和培養(yǎng)上清表達(dá)SDF-1和VEGF的mRNA和蛋白水平變化。 結(jié)果靜脈注射clodronate-lip后可有效清除小鼠脾臟中的MC/Mφ;脂質(zhì)體在激光斑處主要為Mφ吞噬,無明顯RPE細(xì)胞和EC吞噬脂質(zhì)體現(xiàn)象。MTT顯示與脂質(zhì)體共培養(yǎng)的RPE和RF/6A細(xì)胞增殖能力無改變,分泌VEGF和SDF-1α無降低;嵌合體小鼠嵌合率 90%,接受年輕骨髓移植的小鼠,MC/Mφ清除后激光后3d激光斑處表達(dá)GFP細(xì)胞面積和比例明顯減少,2wk時(shí)CNVQgGFP細(xì)胞和CNV面積明顯減小�？蛰d體對照組和正常對照組間無明顯差別。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),較之空載體組,3d時(shí)VEGF和SDF-1表達(dá)顯著下降,2wk時(shí)嵌入CNV內(nèi)的GFP細(xì)胞明顯減少,并且分化為EC和SMC細(xì)胞的GFP細(xì)胞明顯減少。接受老年骨髓移植的年輕小鼠清除MC/Mφ后在激光后3d和2wk時(shí)GFP細(xì)胞數(shù)量和CNV面積也顯著減小。新鮮分離的MC和RPE細(xì)胞共培養(yǎng)4h后可刺激RPE細(xì)胞SDF-1 mRNA水平明顯升高,RPE細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下SDF-1α水平在檢測線下,共培養(yǎng)4h和24h時(shí)上清中SDF-1α蛋白水平明顯高于Millicell非接觸共培養(yǎng)的MC和RPE細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中SDF-1α水平;而細(xì)胞共培養(yǎng)沒有上調(diào)VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)論全身清除MC/Mφ可減輕小鼠CNV生成的嚴(yán)重程度,減少骨髓來源細(xì)胞參與CNV的發(fā)生,此過程中伴隨激光后局部VEGF和SDF-1表達(dá)水平下降,可能是這一抑制現(xiàn)象的原因之一;MC可能主要通過與RPE接觸后刺激RPE產(chǎn)生SDF-1而促進(jìn)CNV中的血管發(fā)生,而CNV發(fā)展中VEGF的改變則可能是一種伴隨或者下游表現(xiàn)。
【圖文】：

3.2 單核細(xì)胞純度對單個(gè)核細(xì)胞SSC分析可看到，細(xì)胞主要分兩群，，分別為位于靠右上的MC群和下方的淋巴細(xì)胞群；流式分析顯示MC純度約為70-80%（圖3-1）。圖3-1 新鮮分離的單核細(xì)胞CD14流式檢測：顯示為73.13%的陽性率3.3 ELISA檢測SDF-1α和VEGF3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品曲線和濃度方程SDF-1α：y = -61.72+1281.47x-1616.9x2+511.28x371相關(guān)博士學(xué)位論文 2011年 第06期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E073-7-68

B）4h 2050030003500pEGF(Vg/ml)RPEmonocyte-RPElymphocyte-RPE4h 24h***RPEmonocyte-RPElymphocyte-RPEmonocyte/RPE*A 3-3 ELISA 檢測 SDF-1α及 VEGF 統(tǒng)計(jì)柱狀圖。RPE：單獨(dú)培養(yǎng)；monocyte-R細(xì)胞與 RPE 接觸共培養(yǎng)；lymphocyte-RPE：淋巴細(xì)胞與 RPE 接觸共培nocyte/RPE：Millicell 小室隔離共培養(yǎng)。*P<0.05AB
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R774.5

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本文編號：2552474