【摘要】：角膜是由角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層組成,而角膜上皮層在防止角膜水分散失和外界病原體入侵中具有不可替代的作用。但由于角膜上皮層直接與外界接觸,故易受到損傷和感染而引起結(jié)構(gòu)和功能異常,使角膜上皮發(fā)生不可逆病變,嚴重者則引起角膜上皮盲。在我國約400余萬、全世界約5500余萬角膜盲患者中,許多患者為角膜上皮盲。目前,角膜上皮移植是角膜上皮盲治愈的唯一途徑,但由于捐獻的供體角膜數(shù)量的嚴重不足,致使絕大多數(shù)角膜上皮盲患者無法通過角膜上皮移植而重見光明。組織工程角膜上皮作為供體角膜上皮的替代物,是目前解決供體角膜材料不足的一種新的可行途徑,也是眾多角膜上皮盲患者早日重見光明的唯一希望。為了建立組織工程角膜上皮的體外重建條件,本文擬對業(yè)已建立的人角膜上皮細胞系進行鑒定,并以非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜上皮細胞系細胞為種子細胞、以去上皮層羊膜為載體支架,采用氣-液界面培養(yǎng)法對組織工程人角膜上皮的體外重建進行了研究。 首先,本文利用光鏡觀察、生長特性分析、染色體分析、免疫熒光檢測以及BALB/c裸鼠致瘤性檢驗等方法對業(yè)已建立的人角膜上皮細胞系進行了初步鑒定。光鏡觀察結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞透明度高,形態(tài)飽滿,呈現(xiàn)出穩(wěn)定的上皮樣細胞形態(tài),3天左右即可傳代1次；一生長特性分析結(jié)果顯示,該細胞系細胞的群體倍增時間為45.42小時,表明該細胞系細胞的生長分裂旺盛；染色體計數(shù)與核型分析結(jié)果顯示,該細胞系雖然出現(xiàn)了染色體數(shù)目的非整倍性(42～54條),但其特征性染色體數(shù)目仍為46條,約占細胞總數(shù)的56%,并具有典型的人染色體特征,包括6對中央著絲粒染色體、11對亞中著絲粒染色體、5對近端著絲粒染色體和1對X染色體；免疫熒光檢測顯示,具有角膜上皮細胞特異性的標志蛋白——角蛋白K3的陽性表達；該細胞系細胞致瘤性檢驗結(jié)果顯示,該細胞系細胞皮下接種后沒有引發(fā)腫瘤的形成,表明其沒有任何致瘤性。由此可見,現(xiàn)有人角膜上皮細胞系細胞可以用作組織工程人角膜上皮體外重建的種子細胞。 其次,本文進行了去上皮層羊膜的制備研究。對新鮮羊膜采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1:1)混合液消化30分鐘,經(jīng)細胞刮刀刮擦上皮面后用適量D-Hanks輕輕清洗,獲得去上皮層羊膜,用作組織工程人角膜上皮體外重建的載體支架。 最后,本文以非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜上皮細胞系細胞為種子細胞、以去上皮層羊膜為載體支架,采用氣-液界面培養(yǎng)法進行了組織工程人角膜上皮的體外重建研究。先將去上皮羊膜貼在插入式培養(yǎng)皿底部,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中干貼2天,加入100μL0.01%Ⅳ型膠原,待膠原溶液自然干燥后,向每個插入式培養(yǎng)皿中接種100μL密度為3×106個/mL的種子細胞,24小時候轉(zhuǎn)至氣-液界面,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光鏡觀察結(jié)果顯示,接種后2小時后,角膜上皮細胞即粘附在羊膜上皮面,24小時形成單層,第9天即可形成大約5-8層細胞。組織工程人角膜上皮石蠟切片的HE染色結(jié)果顯示,培養(yǎng)5天時即可形成由3層角膜上皮細胞構(gòu)成的復層上皮、培養(yǎng)7天時即可形成由4-5層角膜上皮細胞構(gòu)成的復層上皮、培養(yǎng)9天時即可形成由5-8層角膜上皮細胞構(gòu)成的復層上皮,其透明度好、表面光滑平整,各層細胞之間連接緊密,且底層細胞與去上皮層羊膜連接緊密；對第9天體外重建組織工程人角膜上皮的免疫熒光檢測結(jié)果顯示,組織工程人角膜上皮的種子細胞具有角膜上皮細胞特異性的標志蛋白——角蛋白K3的陽性表達,同時還能表達整聯(lián)蛋白β1；對第9天體外重建組織工程人角膜上皮的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,組織工程人角膜上皮的種子細胞絕大多數(shù)仍保持有角膜上皮細胞的原有形態(tài),與在體角膜上皮細胞一樣其表面具有微絨毛結(jié)構(gòu),且表層細胞之間結(jié)合緊密,形成了連續(xù)致密的角膜上皮細胞層。上述結(jié)果表明,種子細胞在體外重建后仍保持有角膜上皮細胞的屬性,能形成類似在體角膜上皮的由5-8層細胞構(gòu)成的復層角膜上皮,并具有與載體支架形成錨定連接的能力。 綜上所述,本文以非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜上皮細胞系細胞為種子細胞、以去上皮層羊膜為載體支架,采用氣-液界面培養(yǎng)法成功體外重建出了在形態(tài)和屬性上與在體人角膜上皮近似的組織工程人角膜上皮,為組織工程人角膜上皮的規(guī)�；w外重建及其臨床應用,以及組織工程人全角膜的體外重建奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

a.人角膜上皮細胞，標尺=250林mb，人角膜上皮細胞，標尺二100”ma· hUInancomealePithelialeells，bar=250卜 mb.humaneomealePithelialeells，bar=100林m從繪制的人角膜上皮細胞生長曲線圖2一2可以看出，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)人角膜上皮細胞，，細胞在貼壁生長的前30小時處于遲緩期，第30小時至第78小時處于對數(shù)生長期，第78小時至102小時則基本處于平穩(wěn)期，第102小時開始細胞進入衰亡期。人角膜上皮細胞生長時期時間分布如表2一1所示。經(jīng)計算，細胞群體倍增時間to二t.lgZ/lg(Nt/No)，其中，No為接種細胞數(shù)

對人角膜上皮細胞的300個中期分裂細胞的染色體計數(shù)結(jié)果顯示，雖然該細胞系出現(xiàn)了染色體數(shù)目的非整倍性(42~54條)，但其特征性染色體數(shù)目仍為46條，占細胞總數(shù)的56%(如圖2一3a)，并且具有典型的人染色體特征，包括6對中央著絲粒染色體、11對亞中著絲粒染色體、5對近端著絲粒染色體和1對X染色體(如圖2一3e)。
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R770.2

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 徐彬;組織工程人角膜上皮的體外重建、鑒定及其在新西蘭兔角膜上皮移植中的作用研究[D];中國海洋大學;2012年

本文編號：2547908