【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)可在體外無(wú)限增殖,且保持未分化狀態(tài),其在特定環(huán)境下可被誘導(dǎo)分化為各種組織細(xì)胞,因此成為人體器官功能喪失后替代治療的理想選擇。目前,對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷導(dǎo)致的永久性感音神經(jīng)性耳聾尚無(wú)有效的治療方法,為此,國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者開始探索將ESCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳細(xì)胞并進(jìn)一步治療耳聾的可行性。本研究旨在初步觀察未經(jīng)體外誘導(dǎo)分化的ESCs導(dǎo)入聽力正常及氨基糖甙類藥物致聾大鼠鼓階后,ESCs在內(nèi)耳的存活、分布及分化情況。 第一部分氨基糖甙類藥物性耳聾大鼠模型的建立 目的:觀察阿米卡星對(duì)新生大鼠耳蝸的損傷作用,探討耳蝸毛細(xì)胞完全缺失大鼠模型的建立方法。 方法:9天齡wistar乳鼠30只,隨機(jī)分成聽力正常對(duì)照組(10只)和阿米卡星致聾組(20只)。后者每日一次皮下注射硫酸阿米卡星(500mg/kg),連續(xù)7天。分別于給藥結(jié)束后1周、6周和12周進(jìn)行短純音聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)測(cè)試、耳蝸冰凍切片和掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果:阿米卡星組20只大鼠全部存活,給藥6周后雙耳各頻率ABR閾值大于95 dBSPL,繼續(xù)觀察至12周聽力無(wú)恢復(fù)。掃描電鏡和HE染色觀察顯示給藥6周后耳蝸各回內(nèi)、外毛細(xì)胞全部喪失。 結(jié)論:中等劑量阿米卡星連續(xù)給藥可致新生大鼠耳蝸毛細(xì)胞全部喪失,以及永久性極重度感音神經(jīng)性耳聾,是進(jìn)行干細(xì)胞內(nèi)耳植入治療的理想模型。 第二部分胚胎干細(xì)胞內(nèi)耳植入方法研究 目的:探討外源胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)內(nèi)耳導(dǎo)入的有效方法。 方法:5-6周齡Wistar大鼠10只,右耳為實(shí)驗(yàn)耳,經(jīng)鼓階打孔法植入帶有綠色熒光蛋白(EGFP)的ESCs;左耳為對(duì)照組,不實(shí)施手術(shù)。術(shù)前1周與術(shù)后即刻行ABR檢查,術(shù)后36小時(shí)取雙側(cè)耳蝸?zhàn)霰鶅銮衅?觀察ESCs在內(nèi)耳的存活和分布情況。 結(jié)果:導(dǎo)入的ESCs大部分聚集懸浮于鼓階外淋巴中,少數(shù)在鼓階基底膜嵴及外側(cè)壁貼壁生長(zhǎng),柯替器等中階部位未見有ESCs的分布。ABR檢測(cè)顯示鼓階打孔途徑導(dǎo)入ESCs可使大鼠聽力下降約10 dB。 結(jié)論:經(jīng)鼓階打孔途徑導(dǎo)入耳蝸的ESCs可存活,該操作對(duì)內(nèi)耳損傷小,可作為內(nèi)耳細(xì)胞移植的有效方式。 第三部分胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入藥物致聾大鼠內(nèi)耳后的遷移與分化 目的:探討ESCs在藥物致聾大鼠內(nèi)耳的存活、分布及分化情況。 方法:18只新生Wistar乳鼠隨機(jī)分成2組:正常對(duì)照組(不給予藥物致聾)8只和藥物致聾組10只,左耳陰性對(duì)照,右耳通過鼓階底轉(zhuǎn)打孔途徑導(dǎo)入干細(xì)胞。分別于導(dǎo)入ESCs后2周和6周進(jìn)行內(nèi)耳組織冰凍切片熒光觀察。 結(jié)果:導(dǎo)入2周后,對(duì)照組ESCs全部聚集于鼓階內(nèi),藥物致聾組可見少數(shù)外源細(xì)胞從鼓階遷移至中階;導(dǎo)入6周后,對(duì)照組鼓階、中階均未見存活的ESCs,藥物致聾組在鼓階內(nèi)壁、骨螺旋板、螺旋韌帶、內(nèi)溝細(xì)胞、外溝細(xì)胞和柯替氏器部位可見ESCs分布,其中部分在柯替氏器部位表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)記物myosinⅦa。 結(jié)論:內(nèi)耳損傷的微環(huán)境下,導(dǎo)入內(nèi)耳的ESCs存活期延長(zhǎng),部分由鼓階向中階遷移,少數(shù)可分化為毛細(xì)胞前體細(xì)胞。
【圖文】：

圖 2：阿米卡星對(duì)幼年大鼠耳蝸損傷作用的形態(tài)學(xué)觀察A. 正常大鼠耳蝸柯替氏器，內(nèi)、外毛細(xì)胞完好；B. 給結(jié)構(gòu)，內(nèi)、外毛細(xì)胞缺失，支持細(xì)胞、神經(jīng)纖維及螺旋度受損，CO 構(gòu)架尚在；C. 給藥后 6 周 CO 結(jié)構(gòu)基本塌失，，支持細(xì)胞明顯損傷并基本消失，SGN 嚴(yán)重?fù)p傷；D毛細(xì)胞和支持細(xì)胞完全喪失，整個(gè)基底膜為一層扁平上SGN 嚴(yán)重缺失。標(biāo)尺：AB 分別為 20 μm，CD 為 40 μm11

圖 3：阿米卡星對(duì)幼年大鼠耳蝸損傷作用的形態(tài)學(xué)觀察（掃描電鏡）A. 正常大鼠耳蝸基底膜。I 為內(nèi)毛細(xì)胞，呈一字形整齊排列；O 為外毛細(xì)胞，呈 V 型排列；P 為支持細(xì)胞。B. 給藥 6 周后，基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞完全喪失。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R764

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2545296